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光合成生物における亜硝酸還元酵素およびその電子供与系の生化学的研究

光合生物亚硝酸还原酶及其供电子系统的生化研究

基本信息

批准号：
01F00887
负责人：
長谷俊治
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

光合成生物の窒素同化系では、亜硝酸還元酵素(NiR)やグルタミン酸合成酵素が、フェレドキシン(Fd)を介して光還元力を利用しながら機能している。シアノバクテリアPlectomena boryanumではNiRドメインとFdドメインが融合した新規酵素の存在が知られている。この酵素の反応機構を高等植物やその他のシアノバクテリアの亜硝酸還元系と比較検討することにより、光還元力を利用するための分子機構を解明できると考え、研究を実施してきた。これまで以下の成果を得た。1)Plectonema boryanumからNiR/Fd融合酵素をコードする遺伝子と、Synechococcus sp.PCC6803から従来型のNiR遺伝子を、それぞれPCR法でクローニングした。これらの遺伝子をNiRの補欠分子族であるシロヘム合成を司るcysGの共発現系を活用し、機能をもった活性型の組換え酵素を作製した。2)組換え酵素の活性特性を電子供与体としてFdドメインと従来のFdを用いた場合で解析できる実験系を構築し、両酵素ともFdに依存した活性を持つことを明らかにした。一方、Fdドメインに依存した活性は検出限界以下であることが判明した。3)NiR/Fd融合酵素に対する特異抗体を作製し、P.boryanum細胞内に存在する亜硝酸還元活性としてNiR/Fd融合酵素が生理的に寄与しているかどうか、酵素活性もつ蛋白質画分の抗体で検出、確認した。4)Fdドメインのみを機能的発現させ、電気化学測定法で酸化還元電位を決定し、Fdより大きく電位が高いことを見いだした。そして、このFdドメインはトウモロコシのFd:NADPH酸化還元酵素から電子を受容し、シトクロムcへ電子を供与する、いわゆる電子伝達活性を持つことを確認した。5)このFdドメインからNiRドメインへの電子移動が起こるかどうか、NADPH/FNR/Fdのレドックスカスケードin vitroで再構成し解析した。その結果、FdドメインがNiRドメインと融合した状態であっても、また別個の分子として存在する状態であっても、ドメイン間の電子移動が起こることを見い出した。ただし、この電子移動の速度は、PetFと呼ばれる従来のFdに比べ非常に遅く、NiRの効率のよい触媒反応を支えるには不十分であると結論した。

Photosynthetic organisms are responsible for the utilization of nitrate reductase (NiR) and acid synthase (Fd). The existence of a fusion enzyme is known in the absence of a fusion enzyme. A comparative study on the molecular mechanism of enzyme and other enzymes in higher plants; The following results were obtained. 1)Plectonema boryanum contains NiR/Fd fusion enzyme, Synechococcus sp.PCC6803, NiR fusion enzyme, and PCR. The synthesis of cysG by the complementary molecular family of NiR was studied. The function of cysG was studied. 2) The activity characteristics of group enzyme are electron donor and donor, and the activity of group enzyme is dependent on donor and donor. A party, Fd, Fd 3)NiR/Fd fusion enzyme specific antibody production, P.boryanum cells exist in the presence of nitric acid reduction activity, NiR/Fd fusion enzyme physiological and biological activities, enzyme activity, protein mapping antibody detection, confirmation. 4) The development of Fd function, electrochemistry determination of acidification reduction potential, Fd high potential and high potential The activity of NADPH acidifying reductase is confirmed by electron acceptor, electron donor and electron acceptor. 5) The electron mobility of Fd and FNR is reconstructed from the electron mobility of NIR and NADPH/FNR in vitro. As a result, Fd is the most important element in the fusion state, and other molecules exist in the fusion state. The speed of electron movement is different from the speed of electron movement. The speed of electron movement is different from the speed of electron movement.