光合成生物における亜硝酸還元酵素およびその電子供与系の生化学的研究

光合生物亚硝酸还原酶及其供电子系统的生化研究

• 批准号: 01F00887
• 负责人: 長谷 俊治
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01F00887/
• 关键词: 亜硝酸還元酵素; 光合成; フェレドキシン; シアノバクテリア; 電子伝達

光合成生物の窒素同化系では、亜硝酸還元酵素(NiR)やグルタミン酸合成酵素が、フェレドキシン(Fd)を介して光還元力を利用しながら機能している。シアノバクテリアPlectomena boryanumではNiRドメインとFdドメインが融合した新規酵素の存在が知られている。この酵素の反応機構を高等植物やその他のシアノバクテリアの亜硝酸還元系と比較検討することにより、光還元力を利用するための分子機構を解明できると考え、研究を実施してきた。これまで以下の成果を得た。1)Plectonema boryanumからNiR/Fd融合酵素をコードする遺伝子と、Synechococcus sp.PCC6803から従来型のNiR遺伝子を、それぞれPCR法でクローニングした。これらの遺伝子をNiRの補欠分子族であるシロヘム合成を司るcysGの共発現系を活用し、機能をもった活性型の組換え酵素を作製した。2)組換え酵素の活性特性を電子供与体としてFdドメインと従来のFdを用いた場合で解析できる実験系を構築し、両酵素ともFdに依存した活性を持つことを明らかにした。一方、Fdドメインに依存した活性は検出限界以下であることが判明した。3)NiR/Fd融合酵素に対する特異抗体を作製し、P.boryanum細胞内に存在する亜硝酸還元活性としてNiR/Fd融合酵素が生理的に寄与しているかどうか、酵素活性もつ蛋白質画分の抗体で検出、確認した。4)Fdドメインのみを機能的発現させ、電気化学測定法で酸化還元電位を決定し、Fdより大きく電位が高いことを見いだした。そして、このFdドメインはトウモロコシのFd:NADPH酸化還元酵素から電子を受容し、シトクロムcへ電子を供与する、いわゆる電子伝達活性を持つことを確認した。5)このFdドメインからNiRドメインへの電子移動が起こるかどうか、NADPH/FNR/Fdのレドックスカスケードin vitroで再構成し解析した。その結果、FdドメインがNiRドメインと融合した状態であっても、また別個の分子として存在する状態であっても、ドメイン間の電子移動が起こることを見い出した。ただし、この電子移動の速度は、PetFと呼ばれる従来のFdに比べ非常に遅く、NiRの効率のよい触媒反応を支えるには不十分であると結論した。

Photosynthetic organisms の smothering element assimilation system で は, 亜 nitric acid and enzyme (NiR) や グ ル タ ミ ン acid synthesis enzyme が, フ ェ レ ド キ シ ン (Fd) を interface し て light still force を use し な が ら function し て い る. シ ア ノ バ ク テ リ ア Plectomena boryanum で は NiR ド メ イ ン と Fd ド メ イ ン が fusion し た new rules enzyme の exist が ら れ て い る. こ の enzyme の を 応 authorities higher plants や そ の he の シ ア ノ バ ク テ リ ア の 亜 nitrate component system also beg す と compare 検 る こ と に よ り, light still force を use す る た め の molecular institutions を interpret で き る と え test, research を be applied し て き た. Youdaoplaceholder0 れまで the following を results を obtain た. 1) Plectonema boryanum か ら NiR/Fd fusion enzyme を コ ー ド す る heritage 伝 と, Synechococcus sp. PCC6803 か ら 従 type to の NiR heritage 伝 を, そ れ ぞ れ PCR method で ク ロ ー ニ ン グ し た. こ れ ら の posthumous son 伝 を NiR の fill owe molecular family で あ る シ ロ ヘ ム synthetic を department る cysG の 発 now し l20 を, total function を も っ た activity type の group in え enzyme を cropping し た. 2) for group の え enzyme activity characteristics of を electronic body and supply と し て Fd ド メ イ ン と 従 to の Fd を with い た occasions で parsing で き る be 験 を build し, struck enzyme と も Fd に dependent し た active を hold つ こ と を Ming ら か に し た. One party, Fdドメ に に に depends on <s:1> た activity 検 below the limit, である とが とが is determined to be た. 3) NiR/Fd fusion enzyme に す seaborne る し, the specific antibody を cropping P.b oryanum に exists in cells す る 亜 nitrate also yuan activity と し て NiR/Fd fusion enzyme が physiological に send し て い る か ど う か, enzyme activity も draw points の つ protein antibody で 検 out, confirm し た. 4) Fd ド メ イ ン の み を functionary 発 now さ せ, electricity 気 chemical assay で acidification is yuan potential を decided し, Fd よ り big き く potential high が い こ と を see い だ し た. そ し て, こ の Fd ド メ イ ン は ト ウ モ ロ コ シ の Fd: enzyme NADPH acidification and yuan か ら を electron let し, シ ト ク ロ ム c へ electronic を す and supply る, い わ ゆ る electronic 伝 of active を hold つ こ と を confirm し た. 5) こ の Fd ド メ イ ン か ら NiR ド メ イ ン へ の electronic mobile が こ る か ど う か, NADPH/FNR/Fd の レ ド ッ ク ス カ ス ケ ー ド in vitro で reconstitution し parsing し た. そ の results, Fd ド メ イ ン が NiR ド メ イ ン と fusion し た state で あ っ て も, ま た another の molecular と し て exist す る state で あ っ て も, ド メ イ ン の between electronic mobile が こ る こ と を see い out し た. た だ し, こ の electronic speed of mobile の は, PetF と shout ば れ る 従 to の Fd に than べ very に 遅 く, NiR の sharper rate の よ い catalyst against 応 を branch え る に は not quite で あ る と conclusion し た.

项目成果

A.Setterdahl: "Enzymatic properties of a cyanobacterial nitrite reductase with a bipartite structure containing 4Fe4S/siroheme and 2Fe-2S ferredoxin domains"Plant and Cell Physiology. 44(suppl). S39 (2004)

A.Setterdahl：“具有包含 4Fe4S/siroheme 和 2Fe-2S 铁氧还蛋白结构域的二分结构的蓝藻亚硝酸还原酶的酶学特性”植物和细胞生理学。