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N-アセチルグルコサミン転移酵素I遺伝子の発現制御機構と機能の解析

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I基因表达调控机制及功能分析

基本信息

批准号：
05274213
负责人：
駒野徹
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05274213/
关键词：
Glycosyltransferase N-acetylglucosaminyltransferase

项目摘要

1.GnTIの発現制御機構先に単離したGnTIをプローブとしたノーザン法の解析では、脳で検出された3.3kb mRNAは、他の組織では検出できず、肝臓型の3kb GnTImRNAだけが検出できた。しかし、詳細は脳特異的な配列をプローブとしてノーザン法で解析する必要がある。また、この制御機構解明のため全翻訳領域を含むゲノム遺伝子を単離した。イントロンは翻訳領域内にはなく、5′非翻訳領域内に少なくとも1つ存在していた。また、イントロン内には20塩基よりなる配列が20回繰り返した特徴的な配列が存在していた。得られたクローンが含んでいる、開始コドンの上流1.5kb以内には転写開始部位は含まれていないことがわかった。2.GnTIの簡便な活性測定系の構築(大腸菌での発現)膜貫通領域を中心とするN末側39個のアミノ酸を欠失させたGnTI遺伝子の大腸菌内発現を行なった。この大腸菌の抽出液にはGnTI活性が検出できたので、a)大腸菌で発現させたGnTI蛋白質はGnTI活性を有しており、この系をGnTIの発現、活性測定系として利用できること、b)N末側39アミノ酸はGnTI活性に必須ではないこと、が明かとなった。3.酵母でのGnTIの活性発現酵母での混成型、複合型糖鎖合成のための第1ステップとしてGnTIの発現を試みたが、ウエスタン法で発現は検出できなかった。ラット由来の膜貫通領域が酵母では正常に機能しないのではないかと考え、膜貫通領域を含むN末部分を酵母の膜蛋白質OCH1と置換し、発現を試みた。その結果、このキメラ遺伝子は酵母内で効率良く膜蛋白質として発現し、GnTI活性を示すことが明らかとなった。

1. GnTI gene expression control mechanism was first isolated and GnTI gene expression was analyzed by using the method of gene analysis. 3.3kb GnTI mRNA was detected in other tissues. 3kb GnTI mRNA was detected in liver. It is necessary to analyze the special arrangement in detail. The control mechanism is clear and comprehensive, and the field includes the following components: There is no such thing as a 5′ non-inverted domain. There are 20 different kinds of characters in the array. Get a copy of the file within 1.5kb of the beginning of the file. 2. Construction of a simple assay system for GnTI activity (E. coli production) membrane penetration field with 39 sites at the end of the membrane. The GnTI activity in E. coli extracts was detected.(a) GnTI protein was detected in E. coli extracts.(b) GnTI activity was detected in E. coli extracts.(c) GnTI protein was detected in E. coli extracts. 3. GnTI Activity in Yeast The first step in the synthesis of hybrid and complex glycochains in yeast is to try to develop GnTI activity by using the enzyme method. The membrane protein OCH1 of yeast is replaced by the membrane protein OCH1 of yeast. As a result, the protein expression and GnTI activity in yeast cells were improved.