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DNA修復欠損細胞でのDNA2本鎖切断再結合の試験管内反応系による解析

使用体外反应系统分析 DNA 修复缺陷细胞中的 DNA 双链断裂重组

基本信息

批准号：
09269212
负责人：
立花章
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09269212/
关键词：
DNA2本鎖切断修復アタキシア・テランジェクタシア

项目摘要

アタキシア・テランジェクタシア(AT)は常染色体劣性の遺伝病であり、患者は電離放射線に対して高感受性を示す。AT細胞で2本鎖切断修復に異常があるかどうか、またもしもあれば、その異常が修復後のDNAの構造にどのような影響を及ぼすかを検討した。本研究で用いる試験管内反応系は、制限酵素で切断することによって2本鎖切断を導入したプラスミドDNAを基質とし、これにヒト細胞核の抽出液を加えて修復反応を行わせ、反応生成物を解析するものである。正常人由来線維芽細胞珠N2KYSVの核抽出液を用いて、DNA2本鎖切断の再結合反応の時間経過を検討したところ、反応時間が16時間まで反応産物量は上昇し、その後24時間まで大きな変化は見られなかった。AT2KYSV細胞の核抽出液を用いて同様の検討を行うと、N2KYSVで見られたものと全く同様の時間経過で再結合反応が生じ、再結合反応の効率そのものは正常細胞と差がないことが明らかになった。一方、再結合反応の誤りの頻度について検討したところ、AT2KYSVの核抽出液ではN2KYSVに比べてはるかに高い再結合誤りの頻度を示し、AT2KYSV細胞ではDNA2本鎖切断の再結合反応の正確度が低いことが明らかになった。再結合誤りを含むプラスミドの塩基配列を解析したところ、いずれの核抽出液でも欠失が生じており、しかも殆ど全ての変異体で欠失配列の両端に数塩基の短い反復配列があり、いわゆる非相同組換えによるものであった。N2KYSVから得られた変異体では、欠失領域が比較的広範囲にわたっているのに対し、AT2KYSVでは短い欠失が多く、しかも約80%が同じ45塩基対の欠失であった。しかしN2KYSVでは、この変異は約13%にすぎず、N2KYSVとAT2KYSVとでは、変異頻度だけでなく、変異スペクトルも大きく異なることが明らかになった。これらの結果は、AT細胞ではDNA2本鎖切断の再結合過程に異常があることを示している。

The patient is highly susceptible to ionizing radiation due to autosomal defects. AT cell 2 lock repair abnormal, abnormal, repair DNA structure after the impact of the investigation In this study, we used the method of restriction enzyme cleavage in vitro to introduce DNA into the medium and extract from the nucleus to analyze the reaction products. The time of DNA2 lock cleavage and recombination reaction in nuclear extract from normal human line-derived cell N2KYSV increased after 16 hours, and the amount of reaction product increased after 24 hours. AT2KYSV cell nuclear extract with the same method of study, N2KYSV see the same method of time, then combine the reverse, then combine the reverse efficiency of the same method, then the normal cell. On the other hand, the frequency of recombination errors in AT2KYSV nuclear extracts is higher than that in N2KYSV cells, and the accuracy of recombination errors in AT2KYSV cells is lower than that in N2KYSV cells. In combination with the analysis of the matrix arrangement of the mismatches, the short and repeated matrix arrangement of the mismatches at the end of the mismatches, the short and repeated matrix arrangement of the mismatches, the short and repeated matrix arrangement of the mismatches, the short and repeated matrix arrangement of the mismatches, the short and repeated matrix arrangement of the mismatches, and the short and repeated matrix arrangement of the mismatches. N2KYSV has a wide range of differences and is short of 45%. N2 KYSV and AT 2KYSV vary by about 13%. As a result, AT cells are abnormal in the process of DNA2 lock cleavage and recombination.