新しいCTLA4結合分子、ACBMのcDNA単離とその機能解析

新型CTLA4结合分子ACBM cDNA的分离及其功能分析

• 批准号: 09271201
• 负责人: 村上 正晃
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09271201/
• 关键词: T細胞; 副信号; CTLA4; CD28; B7-1; B7-2; ACBM; B細胞

T細胞の活性化はT細胞受容体からの信号と接着分子からの補助信号が必須である。我々は補助信号分子としてCD28/CTLA4を研究してきた。CD28/CTLA4は共通のリガンドであるB7-1/B7-2を持つ、T細胞上の分子である。CD28は静止期のT細胞から発現していて活性化のための副信号を伝達する。一方、CTLA4は活性化T細胞に発現誘導され、T細胞の不活性化を誘導する。本研究では新たに発見したB細胞上のCTLA4結合分子ACBMの機能解析とcDNAの単離を目的としている。新しいCTLA4結合蛋白を同定するために既知のリガンド、B7-1/B7-2と結合できない可溶性変異型CTLA4の作製を行った。この分子を用いて細胞株を検索し、結合できる細胞が新しいCTLA4結合蛋白を発現していると考えた。CD28/CTLA4の細胞外領域には動物間で高度に保存されたMYPPPYモチーフが存在したのでこのMYPPPYモチーフに点突然変異を加えていった。その結果、最後のPYをAに置換したPYAA変異体がB7-1/B7-2と結合できなかった。このPYAA分子の細胞外領域をIgG1のFc領域と結合させたPYAAIgGを作製し、細胞株を検索してマウス未熟B細胞株、WEHI231細胞に結合を認めた。WEHI231からACBM分子を免疫沈降すると130kDのホモダイマーであることが判明した。ACBMのcDNAを単離するためにCTLA4IgG/PYAAIgGを用いたアフィニティーカラムを作製した。しかし、CTLA4IgG/PYAAIgGの単体への共有結合後、ACBMとの結合が弱まり、目的よりかなり少量のACBMを精製できたのみであった。そのため、精製を続けるためには大量のCTLA4IgG/PYAAIgG分子が必要となり、アデノウイルスを用いた発現系を作製した。この発現系を用いてmgオーダーのCTLA4IgG/PYAAIgGを得ることが可能となり、ACBMの精製とあわせて、CD28/CTLA4-B7/ACBM信号の生体内での機能解析が可能となった。

T cell activation is necessary for T cell receptor activation and subsequent molecular activation. I'm going to try to get rid of CD28/CTLA4. CD28/CTLA4 is a common molecule on B7-1/B7-2 and T cells. CD28 is activated during quiescent T cell activation and signaling. CTLA4 can induce activation of T cells and inactivation of T cells. This study is a novel attempt to elucidate the function of the CTLA4 binding molecule ACBM on B cells. The novel CTLA4 binding protein was identified and the production of soluble variant CTLA4 was carried out in the presence of B7-1/B7-2. This molecule is used in cell strain detection and binding. The new CTLA4 binding protein is found in cells. CD28/CTLA4 extracellular domain is highly conserved among animals, and its existence is highly dependent on its presence. B7-1/B7-2 is the result of the final PY substitution. The extracellular domain of PYAA molecules binds to the Fc domain of PYAA IgG, which binds to immature B cell lines and WEHI231 cells. WEHI231-ACBM molecular weight 130kD The cDNA sequence of ACBM was isolated from CTLA4IgG/PYAAIgG. After the CTLA4 IgG/PYAAIgG monomer is shared, ACBM binding is weak, and a small amount of ACBM is refined. A large number of CTLA4 IgG/PYAAIgG molecules are needed for the production of purified CTLA4 IgG/PYAAIgG molecules. The development of CD28/CTLA4-B7/ACBM signal in vivo is possible due to the purification of CD28/CTLA4-B7/ACBM.

项目成果

Murakami,M.: "Identification and characterization of an alternative CTLA4 binding molecule on B cells." Proc.Natl.Acad.Sci.,USA. 93. 7838-7840 (1996)

Murakami,M.：“B 细胞上另一种 CTLA4 结合分子的鉴定和表征。”

Yamada,A.: "Long-term acceptance of major histocompatibility complex-mismatched cardiac allograft induced by a low does of CTLA4IgM plus FK506." Microbiol.Immunol.40. 513-518 (1996)

Yamada,A.：“长期接受由低剂量 CTLA4IgM 加 FK506 诱导的主要组织相容性复合物不匹配的心脏同种异体移植物。”

Inobe,M.: "The role of B7-la molecule,an alternatively spliced form of murine B7-1 (CD80),on T cell activation." J.Immunol.157. 582-588 (1996)

Inobe,M.：“B7-1a 分子（鼠 B7-1 (CD80) 的选择性剪接形式）对 T 细胞激活的作用。”

Nakagawa,I.: "Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containing CTLA4IgG." Human Gene Therapy. (in press).

Nakakawa,I.：“使用含有 CTLA4IgG 的腺病毒载体进行持续和二次腺病毒介导的肝基因表达。”