大腸菌の機能未知遺伝子郡の実験的手法による網羅的な機能解析

大腸菌におけるゲノムプロジェクトから新しく予測された機能未知の遺伝子群の実験による機能解析の方法論の確立およびそれを用いた解析を目的として、本研究は進められた。1)大腸菌全遺伝子(ORF)の破壊株の作製と変異株のライブラリーの構築(三木)大腸菌遺伝子の網羅的破壊を行うに際し、トランスポゾンを用いた戦略を考察し、そのシステムを開発した。2)必須未知遺伝子の検索方法の開発(山本)大腸菌染色体4.65Mbの上の生存に必須の未知遺伝子を系統的に検索するため、100kbまでの長さの欠失を順次行っていくLCD法を開発した。3)Genetic Footprintingによる遺伝子機能の同定法の大腸菌への適用(北川、森)酵母において開発され、適用されている「Genetic Footprinting」による遺伝子機能の解明法を、大腸菌においても適用できる系の開発を行い、Footprintパターンの元になるバンドパターンを得ることに成功した。今後、適当な選択圧をかけたとき、このパターンの変化を見ることができるように、条件を検討していく必要がある。4)ORF破壊と発現調査ベクターの開発と改良(北川、森、山本)プロモータ活性測定及び極性効果相殺を目的としたプラスミドの開発を行った。このプラスミドベクターを用いて、ターゲットを絞ったORF破壊と発現パターン解析を進める予定である。5)タンパク質相互作用地図作製のためのTwo-hybridシステムの改良(北川、森)大腸菌の全タンパク質の相互作用の解析をすすめるために、酵母のTwo-Hybrid Systemを利用する系の改良を行った。以上のように、大腸菌におけるゲノム機能解析は、システマティックな破壊株作成を目的とした系の開発に、ほぼ目処が付いたと言える。今後、全ORFのクローニングも視野に入れて、上記のようなアプローチを進めていく予定である。

大腸菌におけるゲノムプロジェクトから新しく予測された機能未知の遺伝子群の実験による機能解析の方法論の確立およびそれを用いた解析を目的として、本研究は進められた。1)大腸菌全遺伝子(ORF)の破壊株の作製と変異株のライブラリーの構築(三木)大腸菌遺伝子の網羅的破壊を行うに際し、トランスポゾンを用いた戦略を考察し、そのシステムを開発した。2)必須未知遺伝子の検索方法の開発(山本)大腸菌染色体4.65Mbの上の生存に必須の未知遺伝子を系統的に検索するため、100kbまでの長さの欠失を順次行っていくLCD法を開発した。3)Genetic Footprintingによる遺伝子機能の同定法の大腸菌への適用(北川、森)酵母において開発され、適用されている「Genetic Footprinting」による遺伝子機能の解明法を、大腸菌においても適用できる系の開発を行い、Footprintパターンの元になるバンドパターンを得ることに成功した。今後、適当な選択圧をかけたとき、このパターンの変化を見ることができるように、条件を検討していく必要がある。4)ORF破壊と発現調査ベクターの開発と改良(北川、森、山本)プロモータ活性測定及び極性効果相殺を目的としたプラスミドの開発を行った。このプラスミドベクターを用いて、ターゲットを絞ったORF破壊と発現パターン解析を進める予定である。5)タンパク質相互作用地図作製のためのTwo-hybridシステムの改良(北川、森)大腸菌の全タンパク質の相互作用の解析をすすめるために、酵母のTwo-Hybrid Systemを利用する系の改良を行った。以上のように、大腸菌におけるゲノム機能解析は、システマティックな破壊株作成を目的とした系の開発に、ほぼ目処が付いたと言える。今後、全ORFのクローニングも視野に入れて、上記のようなアプローチを進めていく予定である。