遺伝子破壊による葉緑体遺伝子の機能解析

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植物の葉緑体ゲノムには、原核生物型のATP依存的タンパク質分解に関与するClp複合体の活性サブユニットをコードする遺伝子clpPがコードされている。本研究はタバコ葉緑体形質転換技術を用いてclpPの遺伝子破壊を行い、葉緑体におけるATP依存的タンパク質分解の生理機能を明らかにすることを目的とする。タバコ葉緑体よりclpPを含む断片をクローン化し、clpPと置換する形でスペクチノマイシン耐性を付与するaadAカセットを挿入したコンストラクトを構築した。また下流の遺伝子の発現に与える影響を考慮するコントロールとして、clpPの下流に遺伝子を破壊しない形でaacAカセットを挿入したコンストラクトも構築した。両コンストラクトをパーティクルガンを用いてタバコ葉緑体に導入した。遺伝子破壊株の葉緑体ゲノムは、組換え体分子と野生型分子それぞれおよそ50%ずつにより構成されるヘテロプラズミックな状態にあった。一方コントロール株の葉緑体ゲノムは、サザンハイブリダイゼーションの感度ではすべて組換え型分子に置き換わっていた。形質転換体のシュートをスペクチノマイシンの選択圧下、ホルモンフリーの培地上で発根させたところ、コントロール株では正常な植物体が得られたが、遺伝子破壊株では葉脈が乱れ、著しい葉の形態異常が見られた。さらに葉緑体形質転換体より培地細胞を誘導し、スペクチノマイシンを含む培地上で増殖させた。コントロール株から誘導された培養細胞は緑色で良好に増殖したが、遺伝子破壊株の培養細胞は黄色で著しく生育が悪かった。遺伝子破壊株の葉緑体ゲノムの構成比は、シュートに比べて培養細胞で組換え型分子の占める割合が増加していたが、すべて組換え型分子に置換されることはなかった。このことからclpPの機能は細胞の増殖に必須であることが示唆された。