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クロロプラストーアルカリホスファタ-ゼ融合系タンパクを用いた有機リンセンサの構築

叶绿体碱性磷酸酶融合蛋白构建有机磷传感器

基本信息

批准号：
02205098
负责人：
加藤安彦
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyushu Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

研究目的を達成するための融合タンパクのモデルとして、光合成能がリン酸イオン量に依存するクロロプラスト(またはチラコイド)にアルカリホスファタ-ゼを組み合わせた融合タンパク系を選んだ。このようなタンパク系を固定化し、有機リン酸化合物検出用バイオセンサの構築を主目的とする。さらに、触媒活性喪失アルカリホスファタ-ゼとピエゾ振動子を組み合わせた有機リンセンサの構築も試み、両者の性能を比較検討する。1)チラコイドの単離、精製および固定化チラコイド分画の単離・精製は、ホウレンソウ、レタスを材料として既知の方法で行った。単離したチラコイド分画はきわめて不安定で、約1〜2日間で完全に失活した。そこでチラコイドとアルカリホスファタ-ゼを混合し、ゼラチンーグルタルアルデヒド架橋ポリマー中に固定化したところ、かなり良好な結果が得られた。2)変異アルカリホスファタ-ゼ遺伝子の作成と大腸菌の導入プラスミドpHIーlDNAを制限酵素HindIIIーSalIで処理してアルカリホスファタ-ゼ遺伝子(phoA)断片を得た。この断片をM13mp9ファ-ジに組み込み、大腸菌BMH71ー18にトランフェクションした。目的ファ-ジを選択後、そのDNAを鋳型としてgapped duplex法で、活性中心をなす102番目のセリンをそれぞれアラニンおよびグリシンに改変した。こうして得られた改変phoA遺伝子を、HindIII、BamH Iで切り出してPBR322プラスミドに組み込んだ後、大腸菌SM547株に導入した。プラスミドを持つ大腸菌SM547株を無機リン酸濃度を低減した培地で培養し、その菌体からペリプラズム分画を得た。ペリプラズム分画の中に変異アルカリホスファタ-ゼに相当するタンパク分画が存在することを、SDSーアクリルアミド電気泳動法で確認した。

The objective of this study is to select the best possible combination of photosynthetic energy and the best possible combination of photosynthetic energy. The main purpose of this study is to immobilize organic compounds, and to construct organic compounds. A comparative study of the performance of the catalyst and its constituent parts was carried out. 1) The separation, purification and immobilization of the raw materials are carried out according to known methods. It is unstable and completely inactivated in about 1 ~ 2 days. The results of this study are as follows: 2) The production of different types of DNA fragments and the introduction of pHI DNA into E. coli are controlled by HindIII SalI. This is the case with M13mp9 and E. coli BMH71. Objective: To select the DNA from the genome and modify the DNA by gapped duplex method. After the introduction of PBR322, E. coli SM547 strain, the PBR322 strain was introduced into the plant. coli SM547 strain was isolated by culture with reduced inorganic acid concentration. The difference between the two groups was confirmed by electrokinetic method.