触媒機能喪失タンパクを用いた計測および精密分離法の開発

使用失去催化功能的蛋白质开发测量和精确分离方法

基本信息

批准号：
63604580
负责人：
加藤安彦
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyushu Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

研究目的を達成するための基礎実験として、酵素固定化手法の相違による酵素特性の変化を追跡した。酵素として仔牛腸アルカリホスファターゼを用い、固定化支持体の多孔質ガラスビーズにポリエチレングリコール(PEG)4000または尿素をリンカーとした固定化を試みた。ガラスビーズ表面にトリメトキシシリルプロピルアミンまたはトリメトキシシリルプロピルイソシアナートを反応させ、アミノガラスおよびイソシアナトガラスをそれぞれ得た。1)PEG4000リンカーによる酵素の固定化つぎにPEG4000の両端のOH基に塩化シアヌルを作用させ、二塩化トリアジン基を導入し活性化した。この活性化PEGをアミノガラスに反応させ、ついで酵素を反応させ固定化した。この際、固定化反応の対象となる酵素部位は、主にリシン残基の末端アミノ基である。2)尿素リンカーによる固定化さきに作成したイソシアナトガラスに酵素のリシン-アミノ基を直接作用させると、アミノ基がイソシアナト基のカルボニル炭素に結合して一段階の反応で尿素結合を生成し、効率よく酵素が固定化された。以上の方法による酵素の固定化量および酵素活性を測定した。その結果、尿素リンカー法はPEG4000法に比し酵素の固定化量は30倍と高く、また安定性も大であった。しかし、酵素活性はPEG法の方が尿素法の3.5倍と反対に高いことがわかった。このことは、リンカーサイズに起因するもので、PEGリンカーは長いためループを形成し酵素の固定化が効果的でないのに比べ、尿素法は反応が直接固定化に結びついているためと考えられる。しかしながら、固定化酵素の活性は尿素法の場合、サイズが短いために酵素分子の自由度が束縛され、立体的な制約も強く、ために失活が著しくなったものと考えられる。

作为实现研究目标的基本实验，跟踪了酶固定方法差异而导致酶特性的变化。我们以小牛肠道磷酸酶为酶，尝试使用聚乙烯乙二醇（PEG）4000或尿素作为接头固定固定载体的多孔玻璃珠。三甲氧基丙酰丙胺或三甲氧基丙基异氰酸酯在玻璃珠的表面上反应，分别获得氨基和异糖透明玻璃。 1）接下来将酶固定在PEG4000接头上，将蓝氯化物应用于PEG4000两端的OH基团，并引入了三嗪二氯化剂以激活酶。 This activated PEG was reacted with amino glass, and then an enzyme was reacted to immobilize it. In this case, the enzyme site that is the target of the immobilization reaction is mainly the terminal amino group of the lysine residue. 2）当酶赖氨酸接头固定时，当赖氨酸氨基氨基氨基氨基氨基直接应用于较早制备的异氰酸玻璃时，氨基组与异糖基团的羰基碳结合，在一个步骤中产生尿素键，并有效地固定了酶。 The amount of enzyme immobilized and enzyme activity of enzymes were measured using the above method. As a result, the urea linker method had a 30-fold higher enzyme immobilization amount than the PEG4000 method, and was also more stable. However, it was found that the enzyme activity was higher in the PEG method, which was 3.5 times higher than the urea method.这被认为是由于接头的大小引起的，虽然钉子的链接器很长，但它形成环并固定酶，而尿素方法被认为是因为该反应与固定化直接相关。但是，在尿素法的情况下，固定酶的活性可能是由于酶分子的短尺寸受到约束而引起的，并且酶分子的自由度也很强，导致显着失活。