触媒機能喪失タンパクを用いた計測および精密分離法の開発

点击翻译按钮获取中文摘要

研究目的を達成するための基礎実験として、酵素固定化手法の相違による酵素特性の変化を追跡した。酵素として仔牛腸アルカリホスファターゼを用い、固定化支持体の多孔質ガラスビーズにポリエチレングリコール(PEG)4000または尿素をリンカーとした固定化を試みた。ガラスビーズ表面にトリメトキシシリルプロピルアミンまたはトリメトキシシリルプロピルイソシアナートを反応させ、アミノガラスおよびイソシアナトガラスをそれぞれ得た。1)PEG4000リンカーによる酵素の固定化つぎにPEG4000の両端のOH基に塩化シアヌルを作用させ、二塩化トリアジン基を導入し活性化した。この活性化PEGをアミノガラスに反応させ、ついで酵素を反応させ固定化した。この際、固定化反応の対象となる酵素部位は、主にリシン残基の末端アミノ基である。2)尿素リンカーによる固定化さきに作成したイソシアナトガラスに酵素のリシン-アミノ基を直接作用させると、アミノ基がイソシアナト基のカルボニル炭素に結合して一段階の反応で尿素結合を生成し、効率よく酵素が固定化された。以上の方法による酵素の固定化量および酵素活性を測定した。その結果、尿素リンカー法はPEG4000法に比し酵素の固定化量は30倍と高く、また安定性も大であった。しかし、酵素活性はPEG法の方が尿素法の3.5倍と反対に高いことがわかった。このことは、リンカーサイズに起因するもので、PEGリンカーは長いためループを形成し酵素の固定化が効果的でないのに比べ、尿素法は反応が直接固定化に結びついているためと考えられる。しかしながら、固定化酵素の活性は尿素法の場合、サイズが短いために酵素分子の自由度が束縛され、立体的な制約も強く、ために失活が著しくなったものと考えられる。