クロロプラストーアルカリホスファタ-ゼ融合系タンパクを用いた有機リンセンサの構築

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研究目的を達成するための融合タンパクのモデルとして、光合成能がリン酸イオン量に依存するクロロプラストにアルカリホスファタ-ゼを組み合わせた複合タンパク系を選んだ。このようなタンパク系を固定化し、酸素電極と組み合わせて、アンペロメトリ-型の有機リン酸化合物検出用バイオセンサの構築を主な目的とする。さらに、触媒活性を遺伝子工学的手法で喪失させたアルカリホスファタ-ゼとピエゾ振動子を組み合わせた有機リンセンサの構築も試み、両者の性能を比較検討する。1)クロロプラスト・アルカリホスファタ-ゼ固定化膜の作成単離したクロロプラスト分画は不安定で、4℃のもと約1〜2日間の保存で完全に失活した。そこでクロロプラストとアルカリホスファタ-ゼを混合し、ポリビニルアルコ-ル中に包括固定化したところ、4℃で8日以上も安定で、固定化膜は検出素子としても有効であった。2)有機リン酸化合物センサの構築クロロプラスト・アルカリホスファタ-ゼ・ポリビニルアルコ-ル固定化膜を酸素電極に装着して有機リン酸センサを構築した。基質にグルコ-スー6ーリン酸(G6P)を用いると、G6P濃度が4〜20mMの離囲で酸素発生量と良好な直線関係が認められた。さらに基質として、グルコ-スー1ーリン酸、ウリジル1リン酸、βーグリセロリン酸などにも良好な応答を示した。3)変異アルカリホスファタ-ゼ遺伝子挿入大腸菌の培養gapped deplex法で活性中心のセリン(102)を、それぞれアラニン、グリシンに変えた改変phoA遺伝子を、大腸菌SM547株に導入した。現在、改変phoA遺伝子を導入した大腸菌SM547株の大量培養条件と、産生する変異アルカリホスファタ-ゼの分離・精製条件の検討を行っている。