Merrifield型多孔質ガラス担体の蛋白工学への利用

今年度終了した試験研究において多孔質ガラス表面でDNAを合成するいわゆるMerrifieldの方法について、われわれのグル-プが開発したSPG型(SiーCaーB)とCPG型(SiーB)の二つのタイプの多孔質ガラスを比較しながら条件の最適化を図った。この研究ではこれを更にアミノ酸からペプチドの合成やペプチドのNー末端からアミノ酸の配列順序を決定する方法に適用し、従来からこれらの用途にガラスが適しないとされている点を詳しく具体的に解明しようとした。この結果、アミノ酸の縮合に当たってアミノ基保護のBOC基を取り除く際に酸を使うとこれによってシランカップリング剤の結合が解離することが確認された。アミノ保護基にFmocを用い弱塩基性の処理でこれを取り除くようにすると重合度の大きいペプチドも合成できる事が分かった。また、ガラス上に固定化したペプチドをEdman分解でアミノ酸を1つづつ溶離して行くと10量体ぐらいまでシ-クエンシングが可能であるが、やはり酸にたいする安定性が望まれる。このほか、固定化酵素としてはまえに行ったグルコ-スイソメラ-ゼの他にリバ-ゼと果糖転移酵素について試み、いずれも非常に堅牢で高活性の固定化酵素を得た。また、ヘパリンを固定化しアミノ糖の定量法と蛍光x線による硫酸根の定量からいずれも良く一致する定量を行ったうえで、アンチトロンビンと会合してプロトロンビンの活性化を阻止する活性を測定する検査試薬を利用して固定化されたうえでなお活性が認められる処理条件を見いだした。このようにして固定化されたヘパリンは長時間血液中に浸漬した後にもなお活性が認められる。今後、耐酸性のアミノ化多孔質ガラスを開発して行く。また今期準備を完了した蛋白工学的手法を組み入れて各種の固定化酵素や免疫学的アフィニティ-クロマトグラフィ-へと展開する。

今年度終了した試験研究において多孔質ガラス表面でDNAを合成するいわゆるMerrifieldの方法について、われわれのグル-プが開発したSPG型(SiーCaーB)とCPG型(SiーB)の二つのタイプの多孔質ガラスを比較しながら条件の最適化を図った。この研究ではこれを更にアミノ酸からペプチドの合成やペプチドのNー末端からアミノ酸の配列順序を決定する方法に適用し、従来からこれらの用途にガラスが適しないとされている点を詳しく具体的に解明しようとした。この結果、アミノ酸の縮合に当たってアミノ基保護のBOC基を取り除く際に酸を使うとこれによってシランカップリング剤の結合が解離することが確認された。アミノ保護基にFmocを用い弱塩基性の処理でこれを取り除くようにすると重合度の大きいペプチドも合成できる事が分かった。また、ガラス上に固定化したペプチドをEdman分解でアミノ酸を1つづつ溶離して行くと10量体ぐらいまでシ-クエンシングが可能であるが、やはり酸にたいする安定性が望まれる。このほか、固定化酵素としてはまえに行ったグルコ-スイソメラ-ゼの他にリバ-ゼと果糖転移酵素について試み、いずれも非常に堅牢で高活性の固定化酵素を得た。また、ヘパリンを固定化しアミノ糖の定量法と蛍光x線による硫酸根の定量からいずれも良く一致する定量を行ったうえで、アンチトロンビンと会合してプロトロンビンの活性化を阻止する活性を測定する検査試薬を利用して固定化されたうえでなお活性が認められる処理条件を見いだした。このようにして固定化されたヘパリンは長時間血液中に浸漬した後にもなお活性が認められる。今後、耐酸性のアミノ化多孔質ガラスを開発して行く。また今期準備を完了した蛋白工学的手法を組み入れて各種の固定化酵素や免疫学的アフィニティ-クロマトグラフィ-へと展開する。