RNAポリメラ-ゼII転写開始複合体の活性化機構

RNAポリメラ-ゼII(polII)による転写開始機構、特に転写開始複合体形成における、1.ATP水解要求性と、2.キャッピング酵素の関与、について解析し、以下の結果を得た。<1.ATP要求性に関与する因子の探索>___ー:HeLa細胞抽出液を用いたpolIIによる<in>___ー <vitro>___ー転写開始反応は、ATPのγ位のリン酸基の水解に依存する。アデノウイルス後期主要プロモ-タ-を鋳型として転写開始反応を行なわせた場合、ATPの存在に依存して40ー50Sの転写開始複合体が形成された。分離した複合体は活性状態にあり、4NTPを添加すると、正確な位置からスタ-トしたRNA鎖を合成した。さらに、ATP非存在下に開始反応を行なった場合についても検討したところ、ある種の不活性な複合体(前開始複合体、約50S)が形成されていることが明らかとなった。分離した前開始複合体は、4NTPの添加のみでは転写活性を示さなかったが、HeLa細胞核抽出液中のタンパク質性因子の存在とATPの水解に依存して、活性複合体に転換され、転写活性を示した。HeLa細胞核抽出液より、前開始複合体を活性化する因子の精製を試みたところ、活性は少なくとも二つの相補的な分画に分離された。目下、各因子の精製とその機能解析を進めている。<2.キャッピング酵素の機能>___ー:ATP水解に依存して形成される活性転写開始複合体にはキャッピング酵素が特異的に組込まれ機能している。キャッピング酵素の機能をより詳細に理解するために、酵母キャッピング酵素遺伝子を用いて、酵素の機能ドメインの解析を行なった。まず、種々の人工欠失変異体を用いた実験から、酵素分子全体がその活性発現に重要であることが示唆された。また、T7RNAポリメラ-ゼを用いた大腸菌発現系を利用し、キャッピング酵素を大量にかつ高度に精製した。現在、この酵素を用いて、活性中心近傍のアミノ酸配列の決定を試みると共に、polIIとの相互作用の有無について検討している。

RNAポリメラ-ゼII(polII)による転写開始機構、特に転写開始複合体形成における、1.ATP水解要求性と、2.キャッピング酵素の関与、について解析し、以下の結果を得た。<1.ATP要求性に関与する因子の探索>___ー:HeLa細胞抽出液を用いたpolIIによる<in>___ー <vitro>___ー転写開始反応は、ATPのγ位のリン酸基の水解に依存する。アデノウイルス後期主要プロモ-タ-を鋳型として転写開始反応を行なわせた場合、ATPの存在に依存して40ー50Sの転写開始複合体が形成された。分離した複合体は活性状態にあり、4NTPを添加すると、正確な位置からスタ-トしたRNA鎖を合成した。さらに、ATP非存在下に開始反応を行なった場合についても検討したところ、ある種の不活性な複合体(前開始複合体、約50S)が形成されていることが明らかとなった。分離した前開始複合体は、4NTPの添加のみでは転写活性を示さなかったが、HeLa細胞核抽出液中のタンパク質性因子の存在とATPの水解に依存して、活性複合体に転換され、転写活性を示した。HeLa細胞核抽出液より、前開始複合体を活性化する因子の精製を試みたところ、活性は少なくとも二つの相補的な分画に分離された。目下、各因子の精製とその機能解析を進めている。<2.キャッピング酵素の機能>___ー:ATP水解に依存して形成される活性転写開始複合体にはキャッピング酵素が特異的に組込まれ機能している。キャッピング酵素の機能をより詳細に理解するために、酵母キャッピング酵素遺伝子を用いて、酵素の機能ドメインの解析を行なった。まず、種々の人工欠失変異体を用いた実験から、酵素分子全体がその活性発現に重要であることが示唆された。また、T7RNAポリメラ-ゼを用いた大腸菌発現系を利用し、キャッピング酵素を大量にかつ高度に精製した。現在、この酵素を用いて、活性中心近傍のアミノ酸配列の決定を試みると共に、polIIとの相互作用の有無について検討している。