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酵母転写制御蛋白Gal80の機能領域の解析

酵母转录调控蛋白Gal80功能区分析

基本信息

批准号：
02263211
负责人：
深沢俊夫
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

A:研究目的酵母におけるガラクリ-ス代謝系酵素の構造遺伝子群<GAL1.7.10>___ーの転写は、<GAL4>___ーと呼ばれる遺伝子によってコ-ドされる蛋白が各遺伝子の上流にある17塩基対の共通配列(UAS)に結合することによって促進される。ガラクト-スの存在しないときには、<GAL80>___ーと呼ばれる遺伝子のコ-ドする蛋白に結合することによってその転写促進機能を抑える。本研究では、Gal80蛋白に関する上記の仮説を検証する。B:研究成果 1)Gal80蛋白の精製法の改良と一次構造の解析;Gal80を、酵母内で<ENO1>___ー(エノラ-ゼの構造遺伝子)のプロモ-タ-を利用した高発現ベクタ-を用いて生産し、すでに得られている抗体を用いるウエスタンブロット法により検出しながら精製してきたが、時として精製標品のなかにアミノ末端一部を欠いた蛋白が混在していた。そこで、各種プロテア-ゼ阻害剤を用いてこの問題を解決することが出来た。すなわち、ロイペプチン、フェニルメチルスルフォニルフルオライド、ペプスタチン、アンチパインの混合物を加えることにより完全な蛋白の回収率を上げることが出来た。その結果、湿重量50グラムの菌体より、約2.3ミリグラムの、純度80%以上の精製標品を得ることが出来た。2)精製されたGal80蛋白のゲル漉過法およびSDSゲル電気泳動法による相対分子量の測定結果から、本蛋白が生理的状態では単量体で存在することが判明した。また、そのアミノ末端がアセチル基でブロックされていることが明らかにされた。3)Gal80とGal4との相互作用;ゲルシフト法によって、Gal4/UAS複合体と上記の精製Gal80との結合を検討したところ明確なGal80/Gal4/UAS複合体が観察された。この複合体にガラクト-スまたはその代謝経路上の誘導体を加えても乖離は見られなかった。C:今後の展望このようにしてGal80蛋白の大量精製の方法が確立したので今後、誘導物質ならびGal4との相互作用を物理化学的に解析していきたい。

A: The purpose of this study is to investigate the interaction between yeast enzymes and the upstream 17<GAL1.7.10><GAL4>-mer common alignment (UAS). The <GAL80>presence of a protein in a cell can inhibit the function of protein binding. This study demonstrated that Gal80 protein was related to the expression of Gal80 protein. B: Research results 1) Improvement of purification method of Gal80 protein and analysis of primary structure; utilization of Gal80 protein in yeast; production of high yield; production of antibody; purification of Gal <ENO1>80 protein; purification of Gal 80 protein; and mixing of protein at the end of purified standard. All kinds of problems can be solved. A mixture of the following ingredients is added: 1. The recovery rate of complete protein is increased; 2. The recovery rate of protein is increased. The results showed that the wet weight of 50 g/ml of bacteria was about 2.3 g/ml, and the purity of more than 80% of the refined standard was obtained. 2)The purified Gal80 protein was determined by the relative molecular weight measurement results of the two methods, i.e., SDS-electrophoresis, and the presence of the protein in a physiological state. The end of the game is the end of the game. The end of the game is the end of the game. 3) The interaction between Gal80 and Gal4; Gal4/UAS complex and Gal80 complex; Gal80/Gal4/UAS complex. The complex is a complex of inducers on the metabolic pathway. C: Future prospects for the purification of gal80 protein in large quantities have been established. In the future, the interaction between inducing substances and gal4 has been analyzed.