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3‐イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の基質認識及び反応機構の動的解析

3-异丙基苹果酸脱氢酶底物识别及反应机制的动态分析

基本信息

批准号：
03236215
负责人：
柿沼勝己
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

3‐イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の反応機構及び基質認識を明らかにするため,基質アナログ及びホモログを合成して酵素反応の速度論的解析を行なった。3‐イソプロピルリンゴ酸の1‐カルボキサミド誘導体は基質活性、阻害活性とも全く示さず,酵素との親和性が認められなかった。これは,基質1位のカルボキシレ-トイオンと酵素活性中心のアルギニン残基との静電相互作用が基質認識に必須であることを意味する。不拮抗的阻害剤として開発した基質の2‐0‐メチル誘導体の抗菌性を調べたが活性はなかった。酵素との親和性の低下によると思われる。リンゴ酸の3位をメチル,エチル,イソブチル,t‐ブチル,イソアミルとした基質ホモログを,ジアセトングルコ-スの不斉構造を活用する我々の方法でエナンチオ選択的に合成し,酵素反応の速度論的解析に付した。酵素との親和性(Km)はイソブチル体が最も大きく,また反応速度(Kcat)はエチル体が最も高かった。しかし,酵素としての効率を示すKcat/Kmは本来のイソプロピルが最も高いという興味深い結果を得た。このことは,酵素と基質の間の疎水結合が基質の認識に重要な役割を担っていることを示すものである。3‐(1‐フルオロ‐1‐メチルエチル)リンゴ酸を機構依存的自殺基質として設計合成し酵素反応に付した。NADHの産生は認めたが阻害はなかった。酵素との反応液を ^<19>F‐NMRで調べたところフッ化物イオンの生成が確認された。反応の生成物として2‐オキソ‐4‐メチルペンテン酸を推定し,それを合成によって確認した。これは,フッ素化基質が当初の目論見通り酵素反応を受けた後脱フッ化水素まで進行したことを示す。期待した酵素内の求核性官能基による共有給合の形成が生起しなかったのは,立体障害による反応性の低下かあるいは酵素活性中心に適当な求核性官能基がないことを示すものと考えられる。

3. The understanding of the reaction mechanism and matrix of the enzyme for the synthesis of 3-nitro-acetic acid dehydrin and the analysis of the rate-theoretic analysis of the enzyme for the synthesis of matrix and matrix 3. The enzyme affinity is recognized by the substrate activity, the inhibition activity, and the total enzyme affinity. The electrostatic interaction of the enzyme active center residues in the substrate 1 site is essential for substrate recognition. 2 - 0 - 1- Enzyme affinity is low. 3-position synthesis of acid, 3-position synthesis, 3-position synthesis, 3-position Enzyme affinity (Km) is the highest in the group, and enzyme reaction speed (Kcat) is the highest in the group. Kcat/Km is the most interesting enzyme in the world. The enzyme and the substrate are bound to each other by water. The enzyme and the substrate are important for understanding. 3‐(1‐ FULLO ‐1‐ MERICHELE) acid is an institution-dependent suicide substrate and is responsible for the design, synthesis and enzymatic reaction. NADH production is not recognized. F-NMR <19>spectra of the enzyme's reaction solution confirm the formation of the enzyme's reaction solution. 2 - 4- This is the first time that the enzyme has been used to purify the substrate. It is expected that the formation of nuclear functional groups in enzymes will be initiated, and the stereo-barrier will be lowered.