3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性複合体の形成機構と機能制御

3-异丙基苹果酸脱氢酶活性复合物的形成机制及功能调控

• 批准号: 07229215
• 负责人: 柿沼 勝己
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07229215/
• 关键词: 高度好熱菌; 機構依存的阻害剤; 配座固定型基質類縁体; 部位特異的変異; 3-ビニルリンゴ酸; Thermus thermophilus

補酵素NAD^+の存在下IPMから2-オキソイソカプロン酸への酸化・脱炭酸を触媒する3-イソプロピルリンゴ酸(IPM)脱水素酵素(IPMDH, E. C.1.1.1.85)の超分子形成機構や機能制御について、高度好熱菌Thermus thermophilus HB-8由来の酵素により検討した。新規阻害剤として設計した3-ビニルリンゴ酸(VM)は強力な可逆的拮抗阻害剤であった。VMは活性部位で何らかの変換を受けた後に阻害作用を示すと考え、その真の阻害剤活性構造を明らかにすべくVM存在下の酵素反応をNaBH_4またはNaB^2H_4にて停止して生成物をメチルエステルとしてGC-MSで比較分析し、重水素化2-hydroxy-3- pentenoic acidの生成を確認した。これは、VMから生じた2-oxo-3-pentenoic acidが可逆的なMichael-受容体として阻害活性を現している可能性を示唆する。鎖場構造の基質IPMの酵素活性部位内での立体配座を推定するため、イソプロピルマレイン酸及びイソプロビルフマル酸のエポキシドを配座固定型基質類縁体として合成した。前者がKi17mM,後者が3.2mMの競争的阻害活性を示し、活性中心における基質の配座を示唆するとともに、基質カルボキシラート認識部位の酵素内での空間配置に対応すると考えられた。自然突然変異体(R85S)や特異的変異(Y36F)で配座が変動するArg-94の機能を調べるため、静電的特性が近縁で炭素鎖長の異なるR94Kの変異体を作製した。Kmは殆ど変化がなかったが、kcatが約1/80に低下した。従って、Arg-94は基質認識より触媒活性に寄与していると考えられた。

Repair enzyme in the presence of NAD ^ + の IPM か ら 2 - オ キ ソ イ ソ カ プ ロ ン acid へ の acidification, decarburization を acid catalyst す る 3 - イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid (IPM) dehydrated vegetable enzyme (IPMDH, E.C.1.1.1.85) The <s:1> supramolecular forming mechanism や can control に た て て て and the highly thermophilic bacteria Thermus thermophilus HB-8 are derived from the gloszyme によ によ 検 検 to た. The new regulation of antagonists と て て design of <s:1> た3-ビニ リ リ <s:1> ゴ ゴ acid (VM) <s:1> strong な reversible antagonists であった. What VM は active site で ら か の variations in を by け を に resistance against role after た す と え test, そ の is の resistance against one of active tectonic を Ming ら か に す べ く の enzymes in the presence of the VM 応 を NaBH_4 ま た は NaB ^ 2 h_4 に て stop し て products を メ チ ル エ ス テ ル と し て GC - MS で comparative analysis し, heavy water element 2 - hydr oxy-3-pentenoic acid を generation を confirmation of た. こ れ は, VM か ら raw じ た 2 - oxo - 3 - pentenoic acid が reversible な Michael - let body と し て resistance against active を now し て い を る possibility in stopping す る. Lock field tectonic の matrix IPM の enzyme active site で の stereo match tombs を す る た め, イ ソ プ ロ ピ ル マ レ イ ン acid and び イ ソ プ ロ ビ ル フ マ ル acid の エ ポ キ シ ド を with a fixed type matrix class try と し て synthetic し た. The former が Ki17mM, latter が 3.2 mM の competition resistance against active を し, active center に お け の る matrix with a を in stopping す る と と も に, matrix カ ル ボ キ シ ラ ー ト know place の enzymes inside で の space configuration に 応 seaborne す る と exam え ら れ た. Natural - suddenly variants (R85S) や specific variations of different (Y36F) で match が - move す る Arg - 94 の function を adjustable べ る た め, static characteristics of が nearly try で carbon lock long の different な る R94K の - variant を cropping し た. The Km <s:1> almost <s:1> changes がな ったが ったが, kcatが is about 1/80に below た た. Youdaoplaceholder0, Arg-94 <s:1> matrix understanding よ catalyst activity に Correspondence with <s:1> て ると ると study えられた.

项目成果

Tetsuya Aoyama: "Synthesis of DL-thrto-(1-Flusro-i-methglethyl)-and DL-thrto-(1.1.-difluoroethyl)malic acids, Mechamstic Studies of 3-Isopropylmalate Dehydrogenase" J. Chem. Soc., Perkin I,. 1905-1912 (1995)

Tetsuya Aoyama：“DL-苏氨酸-(1-氟-i-甲基乙基)-和DL-苏氨酸-(1.1.-二氟乙基)苹果酸的合成，3-异丙基苹果酸脱氢酶的力学研究”J. Chem。

Yumiko Toyooka: "NADH Mimic on Diautoni-D-Glicoose. Stereoselective Biomimetic-Reduction of Bengoyl-formate and Interpretation of chiraloty Transfer Deduced by Molecular Orbiral Appyoach" Tetrahedron. 51. 6459-6474 (1995)

Yumiko Toyooka：“Diautoni-D-Glicoose 上的 NADH 模拟。苯甲酰甲酸的立体选择性仿生还原和分子轨道 Appyoach 推导出的手性传递的解释”四面体。