細胞周期に依存したDnaA蛋白の活性制御機構

大腸菌の染色体複製は主に開始反応の段階で厳密に制御されているが、その分子機構は不明である。我々は複製開始蛋白DnaAの活性が何らかの機構により調節されており、細胞周期の特定の時期に開始反応を導くことが可能になるという仮説の下に研究を行なっており、本年度は下記の結果を得た。1.細胞周期に対応してdnaA遺伝子の転写量は大きく変動しており、複製開始時期に最大となっている。しかしながらDnaA蛋白はmRNAほど顕著には変動していない。。これはDnaA蛋白が一世代以上にわたって安定に存在しているからである。従ってDnaA蛋白濃度のわずかな上昇により開始反応が引き起こされていると考えられる。2.安定DNA合成を利用して部位特異的なdnaA変異株を作成する方法を開発し、機能不明のN端側領域に変異を持つ株5種類を単離した。これらの変異株はこれまでに得られていた中央部およびC端側に変異を持つ株と異なる性質を示すことから、N端側領域も複製開始に重要な機能を持つことが示唆された。またin vivoでDnaA蛋白のDNAへの結合能を調べる系を開発し、得られた変異により結合能が低下することを明らかにした。さらに、マルチコピーサプレッサーを多数単離し、解析を行なった。これらの中にはN端側変異を特異的に抑制するものがあり、これらの遺伝子を同定することによりDnaAの活性調節機構を解明できるのではないかと考えている。3.染色体地図上95分付近にDnaA蛋白が非常に強く結合する領域が存在し、この領域にDnaA蛋白により抑制されているプロモーター活性が存在することを見出した。この領域を持つプラスミドが細胞内に数コピー存在すると細胞分裂は阻害される。この細胞分裂阻害機構の研究を通して複製開始反応と細胞分裂の共役機構が解明できるものと期待している。

大腸菌の染色体複製は主に開始反応の段階で厳密に制御されているが、その分子機構は不明である。我々は複製開始蛋白DnaAの活性が何らかの機構により調節されており、細胞周期の特定の時期に開始反応を導くことが可能になるという仮説の下に研究を行なっており、本年度は下記の結果を得た。1.細胞周期に対応してdnaA遺伝子の転写量は大きく変動しており、複製開始時期に最大となっている。しかしながらDnaA蛋白はmRNAほど顕著には変動していない。。これはDnaA蛋白が一世代以上にわたって安定に存在しているからである。従ってDnaA蛋白濃度のわずかな上昇により開始反応が引き起こされていると考えられる。2.安定DNA合成を利用して部位特異的なdnaA変異株を作成する方法を開発し、機能不明のN端側領域に変異を持つ株5種類を単離した。これらの変異株はこれまでに得られていた中央部およびC端側に変異を持つ株と異なる性質を示すことから、N端側領域も複製開始に重要な機能を持つことが示唆された。またin vivoでDnaA蛋白のDNAへの結合能を調べる系を開発し、得られた変異により結合能が低下することを明らかにした。さらに、マルチコピーサプレッサーを多数単離し、解析を行なった。これらの中にはN端側変異を特異的に抑制するものがあり、これらの遺伝子を同定することによりDnaAの活性調節機構を解明できるのではないかと考えている。3.染色体地図上95分付近にDnaA蛋白が非常に強く結合する領域が存在し、この領域にDnaA蛋白により抑制されているプロモーター活性が存在することを見出した。この領域を持つプラスミドが細胞内に数コピー存在すると細胞分裂は阻害される。この細胞分裂阻害機構の研究を通して複製開始反応と細胞分裂の共役機構が解明できるものと期待している。