変異導入によるNa^+共役型V-ATPaseプロテオリピドの機能及び構造解析

通过突变引入对 Na^+ 结合的 V-ATP 酶蛋白脂质进行功能和结构分析

• 批准号: 07276207
• 负责人: 柿沼 喜己
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07276207/
• 关键词: 変異導入; ナトリウムイオン; V-ATPase; プロテオリピド

(1)腸内連鎖球菌Enterococcus hiraeのNa^+共役型V-ATPaseが約11kbサイズのntpオペロン:ntpFIKECGABDHJによりコードされていることを、Primer extension、Northern blot解析等より明らかにした。ntpJ遺伝子の機能を明らかにするために、erythromycin耐性遺伝子の導入によるその破壊株JEM2の作製に成功した。JEM2株はそのNa^+-ATPase活性、主要サブユニットの合成量等で欠損が見られず、NtpJ蛋白はNa^+-ATPase complexの必須サブユニットではないことがわかった。しかしながらJEM2株ではK^+能動輸送系(KtrII)の活性が欠損しており、K^+の蓄積不能によりアルカリ環境下では生育できなかった。この結果はNtpJ蛋白がKtrII系の構成因子であることを示している。(2)本酵素によるNa^+促進性ATP加水分解活性及びNa^+ポンプ活性がN,N´-dicyclohexylcarbodiimide(DCCD)により阻害されることを確認し、その阻害作用が本酵素の共役イオンであるNa^+,Li^+イオンの共存によって解除されることを見い出した。DCCDは本酵素プロテオリピドサブユニット(NtpK)の膜貫通ドメインGlu139に作用することを考えると、共役イオン認識部位がGlu139あるいはその近傍にある可能性が考えられる。(3)各種変異導入による本酵素のイオン認識部位解析の最初の試みとして、NtpKサブユニットのGlu139Asp,Glu139Lys,Glu139Asn変異体作製によるNa^+-ATPaseの機能相補を調べた。その結果、E139K,E139N変異体はもとよりE139D変異体でも全くNa^+-ATPase活性の回復が見られなかった。この結果は、イオン共役に関して結合部位における機能残基間距離も本酵素では重要である可能性を示唆している。

(1)Enterococcus hirae Na^+ co-active V-ATPase is about 11kb in length and ntp protein:ntpFIKECGABDHJ in length, Primer extension, Northern blot analysis, etc. The function of ntpJ gene was clarified, and the introduction of erythromycin resistant gene was successfully carried out. JEM2 strain is deficient in Na^+-ATPase activity, synthesis of major enzymes, etc., and NtpJ protein is deficient in Na^+-ATPase complex The activity of K^+ kinetic transport system (KtrII) in JEM2 strain was deficient, and K^+ accumulation could not be achieved. The result is that NtpJ protein is the constituent factor of KtrII system. (2)The Na^+-promoted ATP hydrolysis activity and Na^+-dependent activity of this enzyme were determined by the inhibition of N, N'-dichlorohexylcarbodiimide (DCCD) on Na ^+-dependent ATP hydrolysis and Na ^+-dependent ATP hydrolysis. DCCD is the enzyme of this enzyme, and the membrane penetration of Glu139 is the function of Glu139. The possibility of Glu139 being recognized by DCCD is examined. (3)The first attempt to analyze the recognition site of this enzyme was to adjust the functional complementarity of Na^+-ATPase by introducing different enzymes into Glu139Asp,Glu139Lys and Glu139Asn. E139K, E139N are different from E139D, and Na^+-ATPase activity is different from E139D. The results show that the distance between functional residues and the enzyme is important.