イオン輸送性回転モーターの膜インターフェイスにおけるサブユニット間相互作用

离子传输旋转电机膜界面处的亚基间相互作用

• 批准号: 16048221
• 负责人: 柿沼 喜己
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16048221/
• 关键词: V-ATPase; ナトリウム; イオン; 腸内連鎖球菌

腸内連鎖球菌Enterococcus hirae Na+輸送性V-ATPaseのV1触媒頭部の主要サブユニットNtpB、イオン輸送に直接関わる膜部分VO部分のイオン結合ローターを構成するNtpK、輸送通路の形成に関わるNtpIサブユニットの性質について、部位特異的変異導入などを通じた生化学的解析により以下の結果を得た。(i)NtpIの第7膜貫通αヘリックスの膜表面近傍に位置すると推定されるH626及びE634残基がV-ATPase NtpI (subunit a)間で保存されている残基であることを見い出した。H626R及びE634Qなどの置換変異体ではV-ATPase活性が完全に失われたことから、これらが新たな機能性極性残基であることがわかった。(ii)NtpKサブユニットの第4膜貫通αヘリックスに存在する酸性残基E139(kE139)はイオン結合の中心残基である。kE139D変異酵素を精製しその性質を調べた結果、ATPase活性に対するNa+の親和性が野生体の約1/4に低下していた。kE139D変異に対する部分サプレッサー変異としてkV138L変異を単離した。kV138残基に対する特異的変異導入の結果、kV138M/kE139D二重変異体でNa+に対する親和性が回復し野生体に近いATPase活性が見られた。kE139のカルボキシル基の空間配置がNa+の親和性に厳密に作用することがわかった。(iv)V1触媒頭部のヌクレオチド結合性について明らかにされていないので、Enterococcus V-ATPase精製V1 NtpBサブユニットに対するATPのphotoaffinity label実験を行い、NtpBサブユニットにヌクレオチド結合部位が存在することを示した。

Enterococcus hirae Na+-transporting V-ATPase V1 catalytic head of the main structure of NtpB, NtpB, NtpK, NtpI transport directly related to membrane part VO part of the NtpK, transport pathway formation related to NtpI transport characteristics, site-specific variable introduction, through biochemical analysis, the following results were obtained. (i) The residues H626 and E634 of V-ATPase NtpI (subunit a) were estimated to be located near the membrane surface of NtpI 7. H626R and E634Q are substituted with different V-ATPase activity. (ii) The acidic residue E139(kE139) is present in the fourth membrane penetration α of NtpK. The activity of kE139D enzyme was about 1/4 lower than that of wild type. kE139D is different from kV138L. The results of specific variant introduction of kV138 residue and Na+ affinity of kV138M/KE139D double variant were compared with those of wild type. The spatial configuration of kE139 and its affinity for Na+ is closely related to the interaction between kE 139 and Na +. (iv) The photoaffinity label of ATP corresponding to the V1 NtpB catalyst head is carried out, and the presence of the NtpB catalyst head binding site is indicated.

项目成果

Identification of nucleotide binding sites in V-type Na+-ATPase from Enterococcus hirae

海拉肠球菌 V 型 Na -ATP 酶核苷酸结合位点的鉴定

• 发表时间: 2004
• 期刊: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68
• 作者: T.Hosaka;T.Murata;Y.Kakinuma;I.Yamato
• 通讯作者: I.Yamato