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テトラサイクリン/プロトンアンチポ-タの結晶化とX線構造解析

四环素/质子反向转运蛋白的结晶和X射线结构分析

基本信息

批准号：
08268224
负责人：
三木邦夫
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は,細胞膜輸送の分子機構を原始レベルで解明することを目的として,テトラサイクリン/プロトンアンチポ-タ(TetAタンパク質)の結晶化とX線結晶構造解析を行い,その完全な三次元立体構造を決定するものである.今年度は,引き続きテトラサイクリン耐性の強いグラム陰性菌のTetAタンパク質(分子量42kDa,アミノ酸残基数401),タンパク質の親水性部分を増加させたタンパク質(デヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をTetAタンパク質のN末端に融合させたタンパク質)を研究の対象として結晶化条件の検索を行ってきた.その結果,界面活性剤としてドデシルマルトシド,沈殿剤としてポリエチレングリコール‐モノメチルエーテル550,添加剤に硫酸亜鉛を用い,温度20度,pH6.5で結晶化を行ったとき,1辺の長さが約0.15mmの板状結晶が得られた.本結晶は,蒸気拡散でアモルファス沈殿状になったタンパク質溶液の中から析出したものである.回転対陰極型のX線発生装置を用いてX線回析実験を行い静止写真を数枚撮影したところ,低分解能の反射を確認できた.この反射が由来する面間隔は約40Aであり,低分子結晶由来の反射と比べると少々大きなものであったが,それがTetAタンパク質由来のものであるかどうかの判断はできなかった.この結晶は結晶化の再現性に乏しいため,新たな結晶化条件の検索に加えて結晶化の再現性を高めることが今後の重要な課題である.

This study aims to elucidate the molecular mechanism of cell membrane transport and to determine the complete three-dimensional structure by crystallization and X-ray crystallographic analysis. In this year, we studied the crystallization conditions of TetA protein (molecular weight 42kDa, amino acid residue number 401), the hydrophilic part of TetA protein (DHFR) and the N-terminal fusion of TetA protein) in negative bacteria. As a result, the interfacial activity was increased to 550 degrees C., the crystallization temperature was 20 degrees C., pH 6.5, and plate-like crystals with a length of about 0.15 mm were obtained. The crystals are evaporated and dispersed in a concentrated solution. The X-ray detector of the cathode type is used in X-ray analysis. The distance between the two surfaces is about 40A. The distance between the two surfaces is about 40A. The distance between the two surfaces is about 40 A. The reproducibility of crystallization is insufficient, and new crystallization conditions are explored to improve the reproducibility of crystallization.