G-CSF刺激による増殖制御に関与する因子の検索

申請者らが同定したG-CSF受容体細胞質領域のG-CSF刺激による増殖抑制、分化に必須な部位と相互作用する種々のタンパク質の同定をおこない、細胞分化のシグナル伝達機構を解明する目的で、G-CSF受容体の細胞質領域のうちG-CSFによる刺激で特異的に分化にともなう増殖抑制を誘導する部位に対するペプチド、すなわち、細胞膜貫通領域に最も近いチロシン残基を含む15アミノ酸からなるペプチドを、G-CSF受容体の活性型であるリン酸化チロシン残基を含むものと不活性型である非リン酸化チロシン残基を含むものとを合成し、これらをAF-アミノトヨパール650担体に共有結合し活性型および不活性型G-CSF受容体にそれぞれ対応するアフィニティーカラムを調製した。次に、G-CSFで刺激したDC62-4細胞から抽出液を調製し、そのなかに含まれるタンパク質のうち活性型アフィニティーカラムに結合し不活性型アフィニティーカラムに結合しないタンパク質を分画した。細胞抽出液中、少なくとも3種類のタンパク質がリン酸化チロシン残基含有アフィニティーカラムに特異的に結合し、かつ、G-CSF刺激でそのチロシン残基がリン酸化され、IL-3刺激ではリン酸化されないことが判明した。したがって、これら3種類のタンパク質はG-CSFによるシグナル伝達系に特異的に関与し、G-CSF受容体と相互作用する因子であることが明らかになった。さらに、得られた3種類のタンパク質のうちのひとつがSTAT3であることが、特異抗体を用いた免疫沈降法およびイムノブロット法により、確認された。

申請者らが同定したG-CSF受容体細胞質領域のG-CSF刺激による増殖抑制、分化に必須な部位と相互作用する種々のタンパク質の同定をおこない、細胞分化のシグナル伝達機構を解明する目的で、G-CSF受容体の細胞質領域のうちG-CSFによる刺激で特異的に分化にともなう増殖抑制を誘導する部位に対するペプチド、すなわち、細胞膜貫通領域に最も近いチロシン残基を含む15アミノ酸からなるペプチドを、G-CSF受容体の活性型であるリン酸化チロシン残基を含むものと不活性型である非リン酸化チロシン残基を含むものとを合成し、これらをAF-アミノトヨパール650担体に共有結合し活性型および不活性型G-CSF受容体にそれぞれ対応するアフィニティーカラムを調製した。次に、G-CSFで刺激したDC62-4細胞から抽出液を調製し、そのなかに含まれるタンパク質のうち活性型アフィニティーカラムに結合し不活性型アフィニティーカラムに結合しないタンパク質を分画した。細胞抽出液中、少なくとも3種類のタンパク質がリン酸化チロシン残基含有アフィニティーカラムに特異的に結合し、かつ、G-CSF刺激でそのチロシン残基がリン酸化され、IL-3刺激ではリン酸化されないことが判明した。したがって、これら3種類のタンパク質はG-CSFによるシグナル伝達系に特異的に関与し、G-CSF受容体と相互作用する因子であることが明らかになった。さらに、得られた3種類のタンパク質のうちのひとつがSTAT3であることが、特異抗体を用いた免疫沈降法およびイムノブロット法により、確認された。