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内因性キロキナーゼ・フォスタファターゼ系によるP型ポンプの可逆的リン酸化とイオン輸送

内源性手足激酶-磷酸酶系统对 P 型泵的可逆磷酸化和离子传输

基本信息

批准号：
09257201
负责人：
谷口和弥
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09257201/
关键词：
H^+,K^-ATPase チロシンキナーゼセリンキナーゼカルシウム

项目摘要

従来までの研究により、H,K-ATPaseのα鎖のTyr10とTyr7が順に、またSer27がH,K-ATPase標品(GI画分)に内在するチロシンおよびセリンキナーゼによってそれぞれリン酸化されることを見いだした。本研究ではα鎖をリン酸化する両キナーゼの性質をα鎖、およびα鎖のリン酸化部位をマルトース結合タンパク質(MBP)と融合させたリン酸化モデル基質(MBP-HK)を用いて検討し、さらに免疫反応から、その同定を試みた。GI画分にCaを添加して内在性キナーゼによるリン酸化反応を行ったところ、Ca濃度に依存(K1/2=0.9μM)してα鎖のセリンリン酸化量が増加したが、チロシンリン酸化はCa濃度に依存しなかった。界面活性剤CHAPS存在下では、α鎖のセリンリン酸化量は減少し、Ca濃度依存性も消失したが、プロテインキナーゼC(PKC)活性化剤TPAを添加すると、Ca濃度に依存(K1/2=1.0μM)したリン酸化が観察された。CHAPS処理前後のα鎖、およびMBP-HKのセリンリン酸化は、PKC特異的阻害剤で阻害した。さらに、抗PKC抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果より、GI画分中にPKCαとPKCβIIが存在することが示され、両PKCともMBP-HKをリン酸化することが明らかになった。一方、チロシンホスファターゼ阻害剤であるバナジン酸存在下で観察されるα鎖のチロシンリン酸化は、pp60src阻害剤ゲニステインで阻害された。抗c-Src抗体を用いたウェスタンプロッティングの結果より、GI画分において分子量5万と6万のc-Src様プロテインキナーゼの存在を確認した。免疫沈降により得られた、免疫複合体を酵素源とするMBP-HKのチロシンリン酸化が観察された。CHAPSで可溶化したGI画分からこの2種のチロシンキナーゼをゲル濾過カラム(Superose12)で分離し、MBP-HKへのチロシンリン酸化能を検討したところ、分子量6万のキナーゼのみがα鎖N末端の配列をチロシンリン酸化することを見い出した。本研究によって、GI画分に内在する膜型のPKCαとβIIがCaに依存して、また膜型のc-Src様チロシンキナーゼがそれぞれα鎖をリン酸化することが示唆された。

In recent studies, Tyr10 and Tyr7 of the α-lock of H,K-ATPase have been identified, and Ser27 and H,K-ATPase standard (GI fraction) have been identified. In this study, the properties of α-lock, α-lock, α-lock and α-lock were studied by using MBP and MBP-HK. GI analysis shows that Ca addition is intrinsic to acidification and Ca concentration dependence (K1/2=0.9μM). In the presence of CHAPS, the amount of α-lock acid decreased, Ca concentration dependence disappeared, and Ca concentration dependence (K1/2=1.0μM) was observed. The α-lock, β-MBP-HK and PKC-specific inhibitors before and after CHAPS treatment In addition, anti-PKC antibodies were used to detect the presence of PKCα and PKCβII in the serum. In the presence of acid, the reaction of a compound with an inhibitor is observed. pp60 src inhibitor The presence of c-Src antibody with molecular weight of 50,000 to 60,000 was confirmed. Immune sedimentation, immune complex, enzyme source, MBP-HK, and enzyme acidification CHAPS is soluble in GI and has two kinds of molecular structure (Superose12), separation, MBP-HK and N-terminal. In this study, the membrane type PKCα and βII are Ca dependent, and the membrane type c-Src is Ca dependent.