分裂酵母複製開始点に結合する核蛋白質複合体

与裂殖酵母复制起点结合的核蛋白复合物

• 批准号: 09263208
• 负责人: 升片 久夫
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09263208/
• 关键词: 真核生物複製開始必須配列; 分裂酵母; 複製開始複合体; 細胞周期; 免疫沈降法

分裂酵母染色体DNAの複製開始とその制御機構を明らかにするために、複製開始蛋白と複製開始点を含む細胞核内構造に関する以下の成果を得た。1.分裂酵母第2染色体上で実際に複製開始点として機能する領域を自律複製断片(ARS2004断片)として分離し、アデニンが連続する配列が繰り返し存在することが複製開始に必須であることを発見した。2.細胞を穏やかに破壊し染色体DNAを含む不溶性画分と可溶性画分に分画する方法を用い、出芽酵母複製開始因子ORC(origin recognition complex)サブユニットの分裂酵母ホモログであるOrp1蛋白は細胞周期を通じて染色体に結合しているのに対し、MCM(minichromosome maintenance)ファミリーに属するMis5蛋白、Nda1蛋白はG1/S期にのみ染色体DNAに結合することを示した。3.間接蛍光抗体法により,Mis5蛋白質は細胞周期を通じて細胞核内に局在するが、G1/S期にのみ染色体上に特異的fociとして検出された。よって、Mis5蛋白は細胞周期特異的に染色体上の特定の領域上に集約的な複合体として局在することが示唆された。4.ホルマリン固定した細胞より免疫沈降法を用いてOrp1-DNA複合体を回収することにより、複製開始点が特異的に検出された。分裂酵母細胞内でORCが複製開始点特異的に結合していることが示唆された。5.可溶化した細胞抽出液より免疫沈降法により回収したOrp1蛋白質(ORC複合体)が、試験管内で分裂酵母複製開始領域DNAに特異的に結合することを発見した。

The following results were obtained from the control mechanism of DNA replication initiation, replication initiation protein, and intracellular structure. 1. The start point of replication on chromosome 2 of yeast is the functional domain of self-replicating fragment (ARS2004 fragment). 2. The method for the separation of chromosomal DNA from insoluble and soluble components in cells, ORC(origin recognition complex), ORP1 protein, MCM(microsomal maintenance), Mis5 protein, Nda1 protein, G1/S phase chromosomal DNA, etc. 3. In the indirect light antibody method, Mis5 protein is detected in the cell cycle, in the nucleus, in the G1/S phase, and in the chromosome. Mis5 protein is a complex of cell-cycle-specific chromosomes that are concentrated in specific domains. 4. Immobilization of cells by immunoprecipitation method and replication initiation of Orp1-DNA complex ORC replication initiation point-specific binding in dividing yeast cells 5. In the solubilized cell extract, the ORP1 protein (ORC complex) was recovered by immunoprecipitation, and the DNA specific binding in the mitotic yeast replication initiation domain was detected in the test tube.

项目成果

升方久夫: "真核生物の複製開始-ヒト細胞と分裂酵母の場合" 細胞工学. 15・1. 41-48 (1996)

Hisao Masukata：“真核生物中的复制起始 - 人类细胞和裂殖酵母的案例”《细胞工程》15・1（1996）。

Yukiko Okuno: "Identification of a predominant replication origin in fission yeast" Nucleic Acids Research. 25・3. 530-536 (1997)

Yukiko Okuno：“裂殖酵母中主要复制起点的鉴定”《核酸研究》25・3（1997）。

Chikashi Obuse: "A replication-enhancing element with transcriptional silencer activity in autonomously replicating human chromosomal fragments" Molecular Biology of the Cell. 7・1. 43-55 (1996)

Chikashi Obuse：“在自主复制人类染色体片段中具有转录沉默活性的复制增强元件”，《细胞分子生物学》7·1（1996）。