ミトコンドリア機能が関与する分裂酵母の硫黄同化経路の解析とシステイン生産への応用

裂殖酵母中涉及线粒体功能的硫同化途径分析及其在半胱氨酸生产中的应用

• 批准号: 19K15728
• 负责人: 田中 尚志
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Saitama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K15728/
• 关键词: 無機硫黄の同化; 分裂酵母; ミトコンドリア; 硫黄代謝; システイン

申請者はミトコンドリアHmt2タンパク質が分裂酵母の硫酸同化に必須であり、Hmt2がチオ硫酸合成に関与することを見出している。本研究では、分裂酵母の硫黄同化経路を明らかにし、さらに、分裂酵母のHmt2と関連因子を大腸菌に導入することによって、安価かつ効率的なシステイン生産系を構築することを目的とした。まずは、分裂酵母を用いた解析に先立ち、大腸菌細胞内でHmt2タンパク質を安定に発現させる系の構築を進めた。大腸菌は無機の硫黄からシステインを合成する２種類の酵素を有している。1つは硫酸経路のCysKと、もう1つはチオ硫酸経路のCysMである。cysK遺伝子破壊株（ΔcysK株）は硫酸単一硫黄源の培地ではシステインを合成できず生育できないが、チオ硫酸単一硫黄源の場合はCysMを介してシステインを合成することができる。そこで、ΔcysK株の細胞内でHmt2が機能できれば、Hmt2によって硫酸からチオ硫酸が合成され、CysM経由でシステインを合成できると予想した。分裂酵母のcDNA情報に基づいて合成したhmt2遺伝子領域を2種類のプラスミド（マルトース結合タンパク質（MBP）融合型と非融合型として発現）にクローニングした。各プラスミドを大腸菌に導入して発現させたところ、野生型Hmt2は膜画分と不溶性画分に、MBP融合型Hmt2は可溶性画分と不溶性画分に存在が認められた。次に、野生型Hmt2およびMBP融合型Hmt2をΔcysK株に導入し、単一硫酸硫黄源培地で生育するか調べた。その結果、野生型Hmt2を発現させたΔcysK株は、硫酸単一硫黄源の培地で全く生育しなかったが、MBP融合型Hmt2を発現させた場合に生育することが分かった。MBP融合型Hmt2は大腸菌の細胞内で硫酸由来の中間代謝物を用いてチオ硫酸に変換可能であることが分かった。

The applicant shall submit a report on the requirements for sulfuric acid assimilation of split yeast and Hmt2. The aim of this study was to construct a production system for sulfur assimilation pathway in Saccharomyces cerevisiae and related factors in Escherichia coli. The construction of Hmt2 protein stability system in Escherichia coli cells Escherichia coli has two kinds of enzymes for the synthesis of sulfur. 1 CysK strain is a kind of CysM strain, which can be synthesized from sulfuric acid and sulfur source. In the cells of the two strains, Hmt2 is functional, Hmt2 is sulfuric acid synthetic, and CysM is synthetic. The hmt2 gene domain is synthesized based on the cDNA information of splitting yeast and is developed in two types of plasmides (MBP fusion type and non-fusion type). The presence of soluble and insoluble components in wild type Hmt2 and MBP-fused Hmt2 is recognized. The wild type Hmt2 and MBP fusion Hmt2 were introduced into the medium, and the medium was cultured with sulfur yellow. As a result, the wild-type Hmt2 strain ΔcysK was found to have all the fertility in the cultivation field with a single sulfur source of sulfuric acid, and the MBP-fused Hmt2 was found to have all the fertility in the field. MBP fusion type Hmt2 is an intermediate metabolite derived from sulfuric acid in Escherichia coli cells.