ミトコンドリア機能が関与する分裂酵母の硫黄同化経路の解析とシステイン生産への応用

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申請者はミトコンドリアHmt2タンパク質が分裂酵母の硫酸同化に必須であり、Hmt2がチオ硫酸合成に関与することを見出している。本研究では、分裂酵母の硫黄同化経路を明らかにし、さらに、分裂酵母のHmt2と関連因子を大腸菌に導入することによって、安価かつ効率的なシステイン生産系を構築することを目的とした。まずは、分裂酵母を用いた解析に先立ち、大腸菌細胞内でHmt2タンパク質を安定に発現させる系の構築を進めた。大腸菌は無機の硫黄からシステインを合成する２種類の酵素を有している。1つは硫酸経路のCysKと、もう1つはチオ硫酸経路のCysMである。cysK遺伝子破壊株（ΔcysK株）は硫酸単一硫黄源の培地ではシステインを合成できず生育できないが、チオ硫酸単一硫黄源の場合はCysMを介してシステインを合成することができる。そこで、ΔcysK株の細胞内でHmt2が機能できれば、Hmt2によって硫酸からチオ硫酸が合成され、CysM経由でシステインを合成できると予想した。分裂酵母のcDNA情報に基づいて合成したhmt2遺伝子領域を2種類のプラスミド（マルトース結合タンパク質（MBP）融合型と非融合型として発現）にクローニングした。各プラスミドを大腸菌に導入して発現させたところ、野生型Hmt2は膜画分と不溶性画分に、MBP融合型Hmt2は可溶性画分と不溶性画分に存在が認められた。次に、野生型Hmt2およびMBP融合型Hmt2をΔcysK株に導入し、単一硫酸硫黄源培地で生育するか調べた。その結果、野生型Hmt2を発現させたΔcysK株は、硫酸単一硫黄源の培地で全く生育しなかったが、MBP融合型Hmt2を発現させた場合に生育することが分かった。MBP融合型Hmt2は大腸菌の細胞内で硫酸由来の中間代謝物を用いてチオ硫酸に変換可能であることが分かった。