真核生物染色体のS期に於ける動態の全て―出芽酵母第六染色体をモデルとして

关于真核染色体 S 期动力学的一切 - 以酿酒酵母 6 号染色体为模型

基本信息

批准号：
11239205
负责人：
白髭克彦
金额：
$ 35.33万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research (2001-2003)Nara Institute of Science and Technology (1999-2000)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

複製チェックポイント制御機構が欠損すると、DNA損傷を修復しないまま、あるいは未複製の染色体を持ったまま、細胞は分裂してしまうため、細胞は死滅あるいは、異常染色体を持ったまま増殖を続けることになる。我々は、チェックポイント制御と複製過程の連携を明らかにするためには一本の染色体のレベルで詳細に複製中の染色体の動態を解析しなくてはならないと考え、出芽酵母第六染色体を解析対象とし、六番染色体全体(280kb)を約13000個の25塩基長の単鎖DNAで余すところなくカバーするカスタムDNAチップを作成した。このDNAチップを用い、いくつかのタンパクの結合領域についてChIP-chip法(Chromatin Immuno-precipitationにより得られたDNAをDNAchip上で検出する方法)により解析を行ったところ1解像度300塩基対でタンパクの結合プロファイルを解析可能であった。同時に我々は複製領域をBrdUでラベルし、抗BrdU抗体で免疫沈降することで検出することにも成功した。この方法により、チェックポイント非活性化時、HU(ヒドロキシウレア)添加による複製異常時(チェックポイント活性化時)のチェック因子及び複製因子の配置を解析した。その結果、MRC1、及びTOF1という二つのチェックポイント因子のみは異常の有無に関係なく、複製伸長複合体の一部として機能していることが明らかになった。さらに、MRC1とTOF1、それぞれの因子の欠失酵母を用い、HU添加時の複製領域と複製伸長因子の相対的配置を解析した。その結果、変異株中では複製伸長因子が複製領域より新鎖合成を行うことなく2-3kb先行して停止することが判明した。このことは、複製の停止はチェックポイント活性化を必要とせず、複製伸長複合体に組込まれたチェック因子により誘導されることを示している。

如果复制检查点控制机制缺失，则细胞在不修复DNA损伤或携带未复制的染色体的情况下进行分裂，从而导致细胞被杀死或继续随着异常染色体而增殖。我们认为，为了阐明检查点控制和复制过程之间的联系，我们必须在一个染色体的水平上详细分析复制过程中染色体的动力学，并创建了一个自定义的DNA芯片，该芯片涵盖所有染色体第六（280KB），约有约13,000个单链单链dnas，约有约25个基底。使用此DNA芯片，通过芯片芯片方法分析了几种蛋白质的结合区域（在DNACHIP上检测到通过染色质免疫 - 沉淀获得的DNA的方法），可以分析以300碱基对分辨率分析蛋白质的结合谱。同时，我们还通过用抗BRDU抗体标记BRDU和免疫沉淀，成功地检测了复制区域。通过这种方法，通过该方法分析了由于HU（羟基脲）添加而引起的复制异常（在检查点激活时）引起的复制异常的放置。结果表明，只有两个检查点因子MRC1和TOF1作为复制扩展复合物的一部分，无论是否存在异常。此外，使用MRC1和TOF1的酵母缺失以及相应的因素用于分析复制区域的相对排列和添加HU后复制伸长因子的相对排列。结果，发现复制伸长因子在突变菌株中提前停止了2-3 kb，而无需从复制区域进行新的链合成。这表明复制停滞不需要检查点激活，并由集成到复制扩展复合物中的检查因子诱导。