染色体複製異常を防御する分子機構の解明

阐明防止染色体复制异常的分子机制

基本信息

批准号：
17013032
负责人：
白髭克彦
金额：
$ 6.08万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17013032/
关键词：
複製異常染色体チェックポイント複製停止染色体異常

项目摘要

HU(ヒドロキシウレア)により複製ストレスが誘導されると、あらかじめ複製装置に組み込まれたチェックポイント因子、Mrc1、Tof1、Csm3により複製が停止し、引き続いて複製チェックポイントの活性化が誘導される。いずれのタンパクを欠損しても、HU存在下では実際の複製領域よりも、複製装置が先行し、さらに複製チェックポイントの活性化は誘導されず、損傷チェックポイント因子を介してチェックポイントが活性化される。複製フォークのHU存在下での動態が酷似しているにも関わらず、これら三者の多重欠失株のHUに対する感受性は相加的になる。我々はMrc1、Tof1、Csm3のフォーク結合の相互依存性及び、これらと相互作用する複製フォークタンパク因子の同定を進めてきた。まず、免疫沈降実験、および、ChIP-chip法による解析の結果、Tof1及び、Csm3の両者がMrc1をフォークに結合させるために必須であることがわかった。逆に、Tof1、Csm3のフォークへの結合にはMrc1は必要としない。従って、Tof1、Csm3の欠失によって引き起こされる複製チェックポィント欠損はMrc1の複製フォークへの結合量に依存していることが示唆される。さらに、それぞれのタンパクを過剰発現する系(Tof1とCsm3は両者を一度に大量発現)を用い、in vivoで相互作用する因子を検索したところ、Mrc1はMcm4、6、7、10と特異的な相互作用が検出されたのに対し、Tof1-Csm3はMcm2、3、5と特異的に相互作用を示した。Tof1単独、あるいはCsm3単独の大量発現ではこの相互作用は認められない。平行して、これらの相互作用に必要なタンパク領域を明らかにするとともに、昆虫細胞の発現系を用い、精製したMrc1、Tof1、Csm3の相互作用および、活性を検討したところ、Tof1とCsm3には一本鎖DNAへの結合能が認められたが、Mrc1には同等の条件で結合は検出されなかった。これらの結果は我々のin vivoでのChIP-chipの結果をよく説明している。

当通过HU（羟基脲）诱导复制应力时，先前已掺入复制装置的检查点因子MRC1，TOF1和CSM3停止复制，并随后诱导复制检查点的激活。无论缺少哪种蛋白质，实际的复制区域都在HU存在的情况下是复制装置，并且不诱导复制检查点的激活，并且通过损坏检查点因子激活了检查点。尽管在HU存在下复制叉具有非常相似的动力学，但这三个多个删除菌株对HU的灵敏度是加性的。我们已经提出了MRC1，TOF1和CSM3的叉子结合以及与之相互作用的复制叉蛋白因子的相互依赖性的鉴定。首先，使用CHIP-CHIP方法的免疫沉淀实验和分析表明，TOF1和CSM3对于将MRC1与叉子结合至关重要。相反，不需要MRC1将TOF1和CSM3与叉子结合。因此，建议由TOF1缺失引起的复制检查点缺乏，CSM3取决于MRC1与复制叉的结合量。此外，当使用过表达每种蛋白质的系统（TOF1和CSM3一次表达两者都表达）的系统相互作用时，我们发现与MCM4、6、7、7和10的特定相互作用检测到了特定的相互作用，而TOF1-CSM3则与MCM2、3和5的相互作用特别相互作用。同时，我们阐明了这些相互作用所需的蛋白质区域，并使用昆虫细胞的表达系统检查了纯化的MRC1，TOF1和CSM3的相互作用和活性。发现TOF1和CSM3具有结合单链DNA的能力，但在相同条件下在MRC1中未检测到结合。这些结果很好地解释了我们的体内芯片芯片结果。