細胞運動刺激因子(AMF)の立体構造に基づく機能解析およびその応用

基于细胞运动刺激因子（AMF）三维结构的功能分析及其应用

• 批准号: 13033032
• 负责人: 羽賀 新世
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Gifu Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033032/
• 关键词: AMF; gp78; receptor binding; metastasis; cell motility; AMF receptor; phosphohexose isomerase; 癌転移; 細胞運動

AMFは腫瘍分泌物中から発見された、細胞運動刺激因子である。その受容体(gp78)は糖蛋白質であり、AMF分泌量およびgp78発現量はともに腫瘍の悪性度と相関していることから、AMF-gp78は腫瘍悪性化因子と考えられている。最近、AMFは細胞内糖代謝酵素PHIと同一分子であったことが報告され、PHIとしての基質認識機構が、AMFとしての受容体認識機構に利用されていると仮定された。本研究では、ヒトAMFを組換え型蛋白質として大腸菌に発現させることによって大量に得て、結晶化を行った。またPHIの阻害剤であるE4PとAMFとの複合体結晶を得た。得られた結晶についてX線解析を行いその立体構造を解いた。その結果、E4Pの各構成原子に有意に近い位置にあるAMFのアミノ酸残基を特定し、これらを他のアミノ酸に置換した変異AMFを18種類作成した。gp78の細胞外ドメイン領域をコードする3種類の組換え型gp78を大腸菌に産生させた。これらのgp78は糖鎖修飾を受けていなかった。マウスgp78全長cDNAに対し、唯一カ所存在する、N-糖側鎖修飾部位を変異させ、蛍光蛋白質(GFP)とともにヒト腫瘍細胞株に安定発現させた。以上の組換え型蛋白質および細胞等を用いた試験を行った結果、AMFのPHIとしての基質リン酸基認識部位を変異させたAMFでは、PHI活性の消失と共に、受容体結合能、細胞運動刺激活性いずれもが減少していた。糖側鎖を持たないgp78蛋白質はAMFによる細胞運動刺激に拮抗しなかった。糖側鎖を有するマウスgp78を発現した細胞をマウスAMFで刺激した場合、gp78の速やかな消失、発現が確認されたのに対し、糖側鎖を持たない場合、これが誘められなかった。従って、AMFのgp78認識にはgp78の糖側鎖が必須であり、その中にはリン酸基あるいはその類似構造が含まれるものと推察された。

AMF is a cell motility stimulating factor. The receptor (gp78) is composed of glycoproteins, AMF secretion and gp78 expression. Recently, AMF has been used to identify the same molecule as PHI. In this study, AMF was synthesized and crystallized in large quantities. E4P and AMF complex crystals were obtained. X-ray analysis of crystal structure and three-dimensional structure were obtained. As a result, the constituent atoms of E4P are intentionally located in the vicinity of the AMF and the AMF residues are specifically located in the vicinity of the AMF residues. gp78 is produced in Escherichia coli by three different groups of cells. Gp78 is a sugar lock modification. Gp78 full-length cDNA, unique gene, N-linked protein, GFP, and stable tumor cell lines As a result of the above experiments, PHI in AMF and its matrix acid base recognition sites changed, PHI activity disappeared, receptor binding energy and cell motility stimulating activity decreased. Glycoside protein gp78 antagonizes cellular motor stimulation by AMF Gp78 is present in the cell, and Gp78 is present in the cell. For example, AMF's gp78 sugar chain must be identified.

项目成果

Funasaka, T., Haga, A., Raz, A., Nagase, H: "Tumor autocrine motility factor is an angiogenic factor that stimulates endothelial cell motility"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 284. 1116-1125 (2001)

Funasaka, T.、Haga, A.、Raz, A.、Nagase, H：“肿瘤自分泌运动因子是刺激内皮细胞运动的血管生成因子”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 284. 1116-1125 (2001

Uemura, H., Tanaka, N., Funasaka, T., Haga, A., Nagase, H., Raz, A., Nakamura, K.T: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of human autocrine motility factor"Protein and Peptide Lett.. 8. 317-322 (2001)

Uemura, H.、Tanaka, N.、Funasaka, T.、Haga, A.、Nagase, H.、Raz, A.、Nakamura, K.T：“人类自分泌运动因子的结晶和初步 X 射线晶体学研究”蛋白质

Tanaka, N., Haga, A., Uemura, H., Akiyama, H., Funasaka, T., Nagase, H., Raz, A., Nakamura, K.T: "Inhibition mechanism of cytokine activity of human autocrine motility factor examined by crystal structure analyses and site-directed mutagenesis studies"J.M

Tanaka, N.、Haga, A.、Uemura, H.、Akiyama, H.、Funasaka, T.、Nagase, H.、Raz, A.、Nakamura, K.T：“人类自分泌运动因子细胞因子活性的抑制机制

Haga, A.: "The Autocrine Motility Factor(AMF)as a Paracrine Motility Factor to Host Vascular Tissues"Recent Research Developments in Biophysical Chemistry. (In press). (2002)

Haga, A.：“自分泌运动因子 (AMF) 作为宿主血管组织的旁分泌运动因子”生物物理化学的最新研究进展。

Haga, A., Funasaka, T., Raz, A., Nagase, H: "The Autocrine Motility Factor signaling induces tumor apoptotic resistance which regulates apoptosome expression"Int.J.Cancer. (印刷中). (2003)

Haga, A.、Funasaka, T.、Raz, A.、Nagase, H：“自分泌运动因子信号传导诱导肿瘤凋亡抵抗，从而调节凋亡体表达”Int.J.Cancer（出版中）。