構造生物学的なAMF-AMFR複合体の解明およびその応用

AMF-AMFR复合物的结构生物学解析及其应用

• 批准号: 15790044
• 负责人: 羽賀 新世
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Gifu Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790044/
• 关键词: AMF; AMFR; MMPs; N-糖側鎖

腫瘍由来の細胞運動刺激因子であるオートクラインモティリティファクター(AMF)の受容体であるAMFrの構造生物学的な知見を得るために、大量精製に有利な原核生物による発現系の構築を試みた。AMFrのヒト完全長、247-、313-、323-、340-、359-、392-C末端およびマウス完全長、219-、279-、322-C末端をそれぞれコードするcDNAを単離し、BamHI、EcoRIあるいはXhoIの切断サイトを5'および3'末端にデザインした遺伝子としてプラスミドに保持させた。これらを大腸菌発現プラスミドに組換え、発現を試みた結果、完全長cDNAでは如何なる発現系を用いても成功しなかった。しかしヒトAMFrのロイシンジッパー、RNGH2モチーフおよびC-末端領域を有する247E-C末端およびC-末端領域のみをコードする392E-C末端のそれぞれのcDNAはGST融合発現系によって大腸菌B株に発現させることに成功した。また宿主大腸菌に予め数種類のシャペロンを過剰発現させたところdnaK-danJ-grpEを共発現させた株に於いて可溶性が向上した。融合GSTを切断して精製したこれらのAMFrには糖鎖が付加しておらず、AMF刺激による細胞運動促進には拮抗しなかった。247E-C末端タンパクは大腸菌培養時、破砕後の可溶化時などに亜鉛を添加すると発現・可溶性の向上が認められた。また亜鉛を添加して精製した247E-C末端タンパクには亜鉛原子が結合していることを確認した。この効果はロイシンジッパー、RNGH2モチーフを含まない392E-C末端タンパクでは得られなかった。いくつかのヒト由来の白血病細胞株にAMFrの発現がみられないことを発見した。しかしこれらの細胞株にAMFを曝露させると分化の誘導が起こる。そこでAMFr遺伝子を導入して発現させたところ、AMF刺激による細胞運動促進がみられ反対に分化誘導は起こりにくくなった。従ってAMFrとは異なる受容体とシグナリングの存在が示唆された。

Cell movement stimulating factors from tumor origin are studied in detail. The receptor of AMF is known as AMFr, and the structure of AMFr is studied. AMFr cDNA complete length, 247-, 313-, 323-, 340-, 359-, 392-C-terminal, complete length, 219-, 279-, 322-C-terminal, complete length, BamHI, EcoRI, 5'-, 3'-terminal, 5 '-terminal, 5'-terminal, 5 This is the first time that E. coli has been successfully developed. The cDNA fusion system of AMFr, RNGH2 and C-terminal domain has 247E-C terminal and 392E-C terminal. The host E. coli was found to be soluble in several species. Fusion GST is cut off and refined. AMFr stimulates cell movement by increasing sugar lock. AMF stimulates cell movement by increasing sugar lock. 247E-C terminal protein was found in Escherichia coli culture, in solubilization after dissolution, in addition to lead, and in solubility. 247E-C terminal of lead atom This is the result of the 392E-C terminal. The development of AMFr in leukemic cell lines from which the virus originated was reported. AMF cell lines were exposed to light and induced to differentiate. AMF-induced cell movement is promoted by the introduction of AMF-induced proteins and by the induction of differentiation. The existence of AMFr and anti-diversity receptors and mechanisms continues to be evident.

项目成果

Haga A, Funasaka T, Niinaka Y et al.: "The Autocrine Motility Factor signaling induces tumor apoptotic resistance which regulates apoptosome expression."Int.J.Cancer. 105. 707-714 (2003)

Haga A、Funasaka T、Niinaka Y 等人：“自分泌运动因子信号传导诱导肿瘤凋亡抵抗，从而调节凋亡体表达。”Int.J.Cancer。

Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of mouse autocrine motility factor.

小鼠自分泌运动因子的结晶和初步 X 射线晶体学研究。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Acta Cryst. D60
• 作者: Naba N;Tanaka N;Shiraiwa K;Kusakabe Y;Funasaka T;Haga A;Nagase N;Raz A;Nakamura;KT
• 通讯作者: KT