プロテオミクス法によるDNA損傷誘発ヒストンH2AXタンパク質複合体の機能解析

蛋白质组学方法分析DNA损伤诱导的组蛋白H2AX蛋白复合物的功能

基本信息

批准号：
14026035
负责人：
井倉毅
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

DNA二重鎖切断が生じた時、クロマチンの構成タンパク質、ヒストンH2AのvariantであるH2AXのC末の139番目のセリン残基が特異的にリン酸化されることがすでに知られている。この事実をもとにクロマチンDNA損傷修復のメカニズムを明らかにするために,ヒストンH2AXをHeLa細胞より精製し,解析を行った。その結果,ヒストンH2AXは複合体を形成することが明らかになった。MS解析およびウエスタンブロット法によりその複合体にはヒストンアセチル化酵素,ユビキチン関連因子などが含まれていることが明らかになり,また実際にヒストンH2AX複合体にヒストンアセチル化酵素活性が存在することを生化学的にも検証した。これらの事実によりH2AXの修飾はリン酸化のみならず,アセチル化,ユビキチン化などの修飾がなされることが示された。またTIP60のヒストンアセチル化酵素活性とH2AXのリン酸化との関わりをヒストンアセチル化酵素活性を欠失させたTIP60変異体のHeLa安定形質株を用いて検討した結果、γ線照射でのDNA損傷時においてこの変異株でのH2AXのリン酸化状態が正常HeLa細胞と比較して有意に抑制されることが示され,DNA損傷時にH2AXがリン酸化されるためにはTIP60のアセチル化活性が必要であるということが明らかになった。

众所周知，当发生DNA双链断裂时，在H2AX的C端位于组蛋白H2a的一种变体的C-末端处的丝氨酸残基被特别磷酸化。基于这一事实，从HeLa细胞中纯化了组蛋白H2AX并分析以阐明染色质DNA损伤修复的机制。结果表明，组蛋白H2AX形成复合物。 MS分析和Western印迹显示，该复合物含有组蛋白乙酰酶和泛素相关因子，并且在生物化学上证明了组蛋白乙酰酶活性实际上存在于组蛋白H2AX复合物中。这些事实表明，H2AX的修饰不仅涉及磷酸化，而且还涉及诸如乙酰化和泛素化等修饰。此外，使用TIP60突变体Hela稳定菌株研究了TIP60的组蛋白乙酰酶活性与H2AX的磷酸化与H2AX的磷酸化之间的关系，该菌株已删除了组蛋白乙酰酶的活性，并且表明该突变体在该突变体中的H2AX的磷酸化状态显着抑制，当DNA损伤被直达型降低时，与γ型降低了，与γ型降低了，相比之下，与γ型损伤相比，与γ型损伤相比，与γ型受损相比在DNA损伤期间，H2AX需要磷酸化。