1分子蛍光イメージング法によるmRNA核外輸送メカニズムの解析

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真核生物はDNAが蓄えられている核とタンパク質が合成される細胞質が核膜で隔てられている。そのため、mRNAの核外輸送は遺伝子発現の調節機構にとって重要な過程である。申請者らは細胞内の任意の高さで蛍光1分子をリアルタイムに観察できる共焦点顕微鏡システムを組み上げ、mRNAを1分子レベルで生きている細胞内で観察してきた。本年度はこれらの研究を発展させ、より詳細にmRNAの核内運動を解析するとともに、mRNAが核外輸送に先立って受けるスプライシング反応をリアルタイムに観察する技術の確立を行った。1.mRNAの核内運動の観察mRNAの核内における拡散運動を詳細に観察した。mRNAの種類を変え、運動に対するmRNAの長さの影響を調べたところ、長さに応じて拡散速度が遅くなった。また、いずれの長さでもその速度は水中の1/100程度であった。一方、蛍光相関法(FCS)を用いて緑色蛍光蛋白質(GFP)の拡散定数を測定し、細胞核内の粘性を見積もったところ、水中の2.2倍しか高くなっていなかった。また、mRNAには運動しているものと止まっているものがおり、その割合はほぼ同じであった。これらの結果から、mRNAは核内で何らかの構造物と非常にすばやく結合解離を繰り返しながら拡散している可能性が示唆された。2.スプライシングの観察mRNAは転写された後スプライシング反応によって、余分な配列(イントロン配列)が切出され、成熟mRNAとなる。最近の知見によれば、転写とスプライシング、核外輸送は密接に関連している事が示唆されている。そこで、mRNAのエキソン、イントロンを別々の色素で染め分け、プリズム分光法を用いてスプライシングを観察する為の技術を確立した。