1分子蛍光イメージング法によるmRNAのプロセシングと核外輸送の解析

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真核生物はDNAが蓄えられている核と蛋白質が合成されている細胞質が核膜で隔てられている。そのため、mRNAの核外輸送は遺伝子発現の調節機構にとって重要な過程である。申請者らは共焦点顕微鏡を用いて、mRNAを1分子レベルで生きている細胞内で観察してきた。本年度はこれらの研究を発展させ、より詳細にmRNAの核内運動を解析するとともに、スプライシング反応をリアルタイムに観察する技術の確立を行った。1.mRNAの核内運動の解析mRNAの核内における拡散運動を詳細に解析した。その結果、mRNAにはほぼ止まっている物と、運動している物がほぼ同じ割合でいた。mRNAの長さを変えて観察したところ、運動しているmRNAは長さによらず同じ拡散速度で動いており、その値は水中の1/100程度であった。一方、蛍光相関分光法(FCS)を用いて核内の粘性を測定した所、水中の3倍程度であり、粘性の変化で説明する事はできなかった。これらの結果から、mRNAは何らかの核内構造物と結合解離を繰り返しながら拡散運動している可能性が示唆された。2.スプライシングの観察mRNAは転写された後スプライシング反応によって、余分な配列(イントロン配列)が切出され、成熟mRNAとなる。最近の知見によれば、転写とスプライシング、核外輸送は密接に関連している事が示唆されている。そこで、mRNAのエキソン、イントロンを別々の色素で染め分け、プリズム分光を用いてスプライシングを観察するための技術を確立した。3.mRNAの細胞質輸送の観察mRNAのある種のものは細胞質に核外輸送された後、特定の部分に局在化し、細胞極性の決定に関与する。そこで、線維芽細胞の先端に局在化し細胞の運動方向の決定に関与するb-actin mRNAを細胞質で1分子蛍光イメージングした。その結果、mRNAは主に拡散運動で局在化している事が明らかになった。