1分子蛍光イメージング法による分子シャペロニンの蛋白質折れたたみ機構解析

单分子荧光成像方法分析分子伴侣蛋白的蛋白质折叠机制

• 批准号: 14037266
• 负责人: 多田隈 尚史
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14037266/
• 关键词: 1分子計測・操作; バイオイメージング; タンパク質の機能; フォールディング

分子シャペロンは蛋白賃の折れたたみを手助けする酵素である。申請者らは1分子蛍光イメージング法を用いて分子シャペロンの一種であるシャペロニンGroELとGroESの結合解離過程を解析し、従来はATPの加水分解が唯一の律速過程と考えられていたシャペロニンの変性蛋白質折れ畳サイクルに未知の中間状態が存在する事を示した。本研究ではこれらの成果を発展させ、以下の成果を得た。1.チロシンの蛍光による構造変化の検出シャペロニンGroELはATPが結合することで大きく構造変化する。チロシン残基の蛍光強度を測定する事でGroELの構造変化をリアルタイムにモニターできる事がわかった。また、変異体を用いた解析により、この蛍光強度変化は、GroELのサブユニットに7残基あるチロシンのうち506番目のチロシン由来である事を特定できた。2.未知の中間体の解析未知の中間体の分子的実体の解明を目指して、より詳細な解析を行った。その結果、この中間体はATPの加水分解と密接に関連している事が明らかになった。また、この中間体の状態では変性タンパク質はGroELのヘリに結合したままで折れたたみ反応がさえぎられており、ふたであるGroESが結合した後一定時間を経ないと、GroELの空洞の中に放出されない事が分かった。この仕組みにより、変性タンパク質はGroELの中に確実に閉じ込められ、その結果、折れたたみ効率が向上していると考えられた。3.プレフォルディンとシャペロニンの相互作用の解析プレフォルディンは真核生物でアクチン等の折れたたみに必須な蛋白質であり、シャペロニンと相互作用することが知られている。本研究ではプレフォルディン、変性蛋白質、シャペロニンをそれぞれ蛍光標識し、蛍光顕微鏡下で観察を行い、平衡定数(kd)を実測した。また、プレフォルディンからの変性蛋白質の解離がシャペロニンによって促進される事を見出した。

The molecule シャペロ である proteins rely on れたたみを to assist けする enzymes である. Applicants ら は 1 molecular 蛍 light イ メ ー ジ ン を グ method with い て molecular シ ャ ペ ロ ン の a で あ る シ ャ ペ ロ ニ ン GroEL と GroES の combining with analytical し を dissociation process, 従 は の ATP hydrolysis process と が の law only speed test え ら れ て い た シ ャ ペ ロ ニ ン の - sex protein folding れ 畳 サ イ ク ル に unknown が の intermediate state The する event を shows that た. The research results of this study are で, れら, れら, を and させ. The following <s:1> results are を and た. 1. チ ロ シ ン の 蛍 light に よ る structure - the の 検 out シ ャ ペ ロ ニ ン GroEL は ATP が combining す る こ と で big き く structure - the す る. チ ロ シ ン residues の 蛍 light intensity を determination す る matter で GroEL の structure - the を リ ア ル タ イ ム に モ ニ タ ー で き る matter が わ か っ た. ま た, 1 - を い た parsing に よ り, こ の 蛍 light intensity variations は, GroEL の サ ブ ユ ニ ッ ト に 7 residues あ る チ ロ シ ン の う ち 506's mesh の チ ロ シ ン origin で あ る matter を specific で き た. 2. Analysis of unknown <s:1> Intermediates <e:1> The physical description of the molecule of unknown <s:1> intermediates <e:1> を the target name of the て and よ detailed な analysis を lines った. Youdaoplaceholder0 <s:1> result, <s:1> <s:1> intermediate <s:1> ATP <e:1> decomposes with water と close contact に related <s:1> て る る matter が clear ら になった になった. ま た, こ の intermediates の state で は - sex タ ン パ ク qualitative は GroEL の ヘ リ に combining し た ま ま で fold れ た た み anti 応 が さ え ぎ ら れ て お り, ふ た で あ る GroES が combining し た after a certain time を 経 な い と, GroEL の hollow の に discharges the さ れ な い matter が points か っ た. こ の blackstone group み に よ り, - タ ン パ ク qualitative は GroEL の に really be in に closed じ 込 め ら れ, そ の results, folding れ た た み が sharper rate upward し て い る と exam え ら れ た. 3. プ レ フ ォ ル デ ィ ン と シ ャ ペ ロ ニ ン の interaction の parsing プ レ フ ォ ル デ ィ ン は eukaryotes で ア ク チ ン の such as folding れ た た み に must な protein で あ り, シ ャ ペ ロ ニ ン と interaction す る こ と が know ら れ て い る. This study で は プ レ フ ォ ル デ ィ ン, variations of protein, シ ャ ペ ロ ニ ン を そ れ ぞ れ 蛍 identification し, 蛍 light 顕 micro microscopically で 観 を line い, equilibrium constant (kd) を be measured し た. ま た, プ レ フ ォ ル デ ィ ン か ら の - sex protein の dissociation が シ ャ ペ ロ ニ ン に よ っ て promote さ れ を る things show the し た.

项目成果

多田隈 尚史: "蛋白質核酸酵素 別冊『RNAの細胞生物学』"共立出版. 556 (2003)

忠隈恒：“蛋白质核酸酶专卷‘RNA的细胞生物学’”共立书刊556（2003年）。

多田隈 尚史: "ナノテクノロジーハンドブック"オーム社(未定). (2003)

Takashi Tadakuma：“纳米技术手册”Ohmsha（待定）。

多田隈 尚史: "実験医学 別冊 『バイオイメージングの最前線』"羊土社. 141 (2002)

忠隈恒：“实验医学专卷‘生物成像的前线’”Yodosha 141（2002）。

Fujiwara I: "Microscopic analysis of polymerization dynamics with individual actin filaments"Nature Cell Biology. 4. 666-673 (2002)

Fujiwara I：“用单个肌动蛋白丝进行聚合动力学的显微分析”《自然细胞生物学》。

Funatsu T: "Rapid and sensitive detection method of a bacterium by using a GFP reporter"Microbiol Immunol. 46. 365-369 (2002)

Funatsu T：“使用 GFP 报告基因快速灵敏地检测细菌的方法”Microbiol Immunol。