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1分子蛍光イメージング法によるmRNA核外輸送メカニズムの解析

单分子荧光成像方法分析mRNA输出机制

基本信息

批准号：
14780516
负责人：
多田隈尚史
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780516/
关键词：
1分子計測・操作バイオイメージング核酸の動態運動・輸送

项目摘要

真核生物はDNAが蓄えられている核と蛋白質が合成される細胞質が核膜で隔てられている。そのため、mRNAの核外輸送は遺伝子発現の調節機構にとって重要な過程である。申請者らは共焦点顕微鏡を用いて、mRNAを生細胞内で1分子観察してきた。本年度はこれらの研究を発展させた。1.mRNAの核内運動の解析mRNAの核内拡散運動を詳細に解析した。その結果、mRNAにはほぼ止まっている物と、運動している物が同じ割合でいた。mRNAの長さを変えて観察したところ、運動しているmRNAは長さによらず同じ拡散速度で動いており、その値は水中の1/100程度だった。一方、蛍光相関分光法(FCS)で核内の粘性を測定した所、水中の3倍程度であり、粘性の変化では説明できなかった。これらの結果から、mRNAは何らかの核内構造物と結合解離を繰り返しながら拡散運動している可能性が示唆された。2.スプライシングの観察mRNAは転写された後スプライシング反応によって、余分な配列(イントロン配列)が切出され、成熟mRNAとなる。最近の知見によれば、転写とスプライシング、核外輸送は密接に関連している事が示唆されている。そこで、mRNAのエキソン、イントロンを別々の色素で染め分け、プリズム分光を用いてスプライシングを観察するための技術を確立した。3.mRNAの核外輸送の観察mRNAの核外輸送速度を測定した所、mRNAは長さによらず約40分で核外輸送された。一方、通常用いられる有機系の蛍光色素は1分程度で退色してしまうため、1分子のmRNAの動きを追跡する事が困難であった。そこで、退色がしにくい半導体量子ドットの有用性を検討した。その結果、量子ドットは色素の10倍明るく、100倍退色しにくかったが、凝集してしまい、核外輸送効率が蛍光色素を用いた場合の1/10程度に低下した。更なる試料調整法の検討が必要な事が分かった。

In eukaryotes, DNA is stored in the nucleus, protein is synthesized in the cytoplasm, and nuclear membrane is isolated. The regulatory mechanism of mRNA transcription is important. The applicant uses a confocal microscope to detect a molecule in the cell where it is produced. This year's research and development will continue. 1. Analysis of mRNA Intranuclear Movement Detailed Analysis of mRNA Intranuclear Movement The result is that the mRNA is not the same as the protein. The mRNA length is 1/100th of the normal value in water. The viscosity in the nucleus was measured by FCS, and the viscosity in the water was 3 times higher. The result is that the mRNA can be dissociated from the nuclear structure, and the possibility of scattering motion can be demonstrated. 2. The mRNA for observation of the Splashine gene is amplified after the Splashine gene is written, and the remaining parts of the gene sequence are extracted and the mature mRNA is obtained. Recently, it has been found that the relationship between nuclear transport and nuclear transport is closely related. The technology of gene expression, gene differentiation, dye analysis, and spectroscopy was established. 3. The speed of mRNA extranuclear transport was measured. mRNA extranuclear transport was measured at about 40 minutes. One side, usually used in the organic system of fluorescent pigments to 1 degree, 1 molecule of mRNA movement to track things difficult. The usefulness of semiconductor quantum devices is discussed. As a result, the quantum pigment was 10 times brighter, 100 times more colorless, aggregated, and the nuclear transport rate was 1/10 lower than that of the fluorescent pigment. The test material adjustment method is necessary for the investigation.