マウス精子形成関連遺伝子群の発現制御とエピジエネテイクスの解析

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1)生後7日、14日、21日、35日の精巣全体を用いて半数体特異的イントロンレス遺伝子Tact1の遺伝子内部のメチル化状態をBisulfite法により調べた結果、生後径時的に脱メチル化されることを明らかにした。この結果は精子形成の進行に伴い脱メチル化が進むことを示唆しているが、精巣全体における生殖細胞の占める比を反映する可能性もある。そこで、各分化段階の生殖細胞を分離し、解析した結果、パキテン期精母細胞で既に脱メチル化されることを確認した。2)Tact1遺伝子は完成した精子が輸精管に移行した後再メチル化される。そのメチル化機構を明らかにするために、既知の新規メチル基転移酵素であるDnmt3aとDnmt3bの生殖系列特異的遺伝子ノックアウトマウ系を用いて、再メチル化に対する既知遺伝子の影響を調べた。Dnmt3a-/-もDnmt3b-/-も再メチル化にはほとんど影響を与えなかった。さらに(Dnmt3a-/-;Dnmt3b+/-)も(Dnmt3b-/-;Dnmt3a+/-)も再メチル化の著しい低下は見られなかった。またDnmt3aとDnmt3bそれぞれに対する特異的抗体を用いて、精子のウエスタンブロッティング及び免疫染色を行ったところ、どちらの蛋白質の存在も確認できなかった。これらの結果は、既知新規メチル化酵素以外に新規メチル化酵素の存在を示唆している。3)半数体特異的イントロンレス遺伝子Oxct2bのコアプロモーターの解析を申請者らが開発したin vivo transient transfection法を用いて行った結果、コアプロモーターは-49/-16の35bpで必要十分であることが明らかとなった。この領域にはTATAボックスやイニシエーターなどの通常見られるプロモーターモチーフが存在せず、cAMP responsive element(CRE)-様配列のみ存在していた。変異コンストラクトのプロモーター活性の検討と特異的抗体を用いたスーパーシフト及びChromatin immunoprecipitationによって、Oxct2bコアプロモーター活性にはCREM転写因子の結合が必須であることが明らかとなった。