特異的γセクレターゼ阻害剤を用いた活性型プレセニリン複合体の調節機構の解析

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1.分子プローブとしての特異的γセクレターゼ阻害剤の作成γセクレターゼを選択的に阻害する遷移状態アナログ型阻害剤,L-685,458にbenzophenoneおよびbiotinを付加した阻害剤(L-852,505)およびBODIPY-FLを付加した阻害剤(BODIPY-L658,458)を作成した.2.L-852,505を用いたプレセニリン(PS)複合体の生化学的解析野生型PS1安定発現株にL-852,505を作用させ,阻害剤依存性に光架橋したタンパクをSDS-PAGEにて分離後,PS1特異抗体で免疫ブロットしたところ,断片型PS1のみを検出した.家族性Alzheimer病関連PS1変異(ΔE9)では,野生型同様にL-852,505によるラベリングを認めたが,機能喪失型PS1変異(D385A)ではラベリング効果を認めなかった.PS複合体の構成因子であるnicastrin, APH-1, PEN2を共発現した細胞(ANPP)ではPS1断片のラベリング効果の著明な亢進を認め,活性型PS1複合体の形成増加が示唆された.3.BODIPY-L658,458を用いたPS複合体の免疫組織学的解析ANPP細胞においてBODIPY-L658,458染色を行うと,その蛍光は細胞表面からearly endosomeに検出した.内在性PS発現細胞ではBODIPY-L658,458の蛍光強度は低かった,しかしながら,L-852,505を界面活性剤非存在下で培養細胞に作用させ,光架橋後,抗biotin抗体で免疫染色を行ったところ細胞表面に蛍光を検出し,内在性レベルでも細胞表面にPSを検出した.