細胞膜コレステロールに依存するウイルス侵入機構の動態解析

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ラフト,カべオラは,コレステロール/スフィンゴ脂質に富み,細胞内シグナル伝達との関連性が着目されている膜ドメインである.我々は,ウイルス侵入に利用され得るカべオラエンドサイトーシスに関して解析を行っている.その中で,カべオラはヒトコロナウイルス-229E (HCoV-229E)の細胞内侵入に利用される可能性を見出し,これまで報告してきた.今年度は,HCoV-229Eがカべオラから細胞内に侵入する際のエンべロープ膜,カべオラ膜の動態をとらえるため,凍結超薄切片を作製し,免疫電顕法にて,細胞内侵入過程の詳細な検討を行った.まず,エンべロープ膜を追跡するため,HCoV-229Eのエンべロープを認識する抗体が必要とされた.そこでS-proteinに対する抗体を作製した.抗N-protein抗体とともに,作製した抗S-protein抗体も用いて免疫電顕解析を行った.HCoV-229E結合後,3-4時間培養した細胞を固定し解析を行ったところ,細胞表面においては,1)複数のカべオラが集合し,ウイルスを取り込むような像,2)エンべロープ膜とカべオラ膜が癒合した像が認められた.次に,細胞内においては,1)単一のカべオラ小胞に取り込まれたヌクレオカプシド像,2)複数のカべオラ小胞の癒合した膜に取り込まれたヌクレオカプシド像,3)脱殻して膜がなくなったヌクレオカプシド像が認められた.以上のことから,HCoV-229Eは,細胞内侵入の際1)複数のカべオラが集まり,エンべロープとカべオラ膜の膜癒合が起こり,2)カべオラエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ,3)複数のカべオラが集まって形成されたカべオソームに移動し,やがて脱核する経路を経る可能性が考えられる.