ゲノムアレイによる蛋白結合領域の網羅的検出法の開発に基づく癌の転写制御異常解析

点击翻译按钮获取中文摘要

申請者は、独自に開発してきたBACクローンを搭載したゲノムアレイを用いて肺癌細胞株のゲノムコピー数解析を行ってきた。このBACアレイ上に、既に確立されているクロマチン免疫沈降法を展開することにより、ヒトゲノムDNAの98%を占める非コード領域に存在する機能的DNAエレメントの俯瞰的検システム(ChIP on BAC array法)の確立を行った。この方法は、まず、転写因子などDNA結合蛋白質に対する抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行う。得られたDNA断片をアダプターPCR法にて増幅し、免疫沈降したサンプルをCy3で、またコントロールとして免疫沈降する前のゲノム断片をCy5にて蛍光標識し、ゲノムアレイにハイブリダイズするものである。今回、800種類の癌関連遺伝子を含むBACを搭載したゲノムアレイを用いて、ヒトグリオーマ細胞株T98Gに対し、転写因子E2F1を解析したところ、E2F1の既知の標的遺伝子であるCCNA2、NMYCを含むスポットが3回の繰り返し実験を経ても陽性になることを確認した(Yokoi S.Molecular Medicine 2005)。また、この他にも複数の陽性スポットが検出され、この中に含まれる遺伝子に対し、RT-PCR法、ChIP-PCR、ルシフェラーゼ・アッセイ、ゲルシフト・アッセイによる評価を行い、E2F1の新規標的遺伝子を同定し得た。現在これらの遺伝子につき解析を進めている。以上より、研究目的は達成されたと考える。