GTP結合型低分子量GTPaseの細胞内局在の網羅的解析

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各種Rasファミリー、Rhoファミリー分子の多重染色法に関しては、複数の結合ドメインについて異なるタグをもつプーローブを各種用意した。これらを用いてRasが活性化している癌細胞株などにおいて活性化部位の二重染色を行ない、活性化部位の詳細な検討を進めた。本研究で確立した内在性Rac1の活性化部位の可視化技術の組織への応用としては、まず骨格筋細胞におけるインスリン刺激に応答した糖取り込み誘導のシグナル伝達系におけるRac1の機能解析を進めた。昨年度までに未分化筋細胞株L6を用いて解析を進めてきたが、今年度は低血清濃度下で分化誘導した筋管においても、インスリン刺激した際の糖取込みの誘導において、Rac1の活性化が必要十分であることを示した。内在性Rac1の活性化部位の可視化技術を応用して、細胞表面のラッフル膜上でRac1の活性化が起こることを示した。細胞内部位特異的に活性化されたRac1によるトランスフェリン受容体および上皮増殖因子受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの抑制機構についても昨年度に引き続き解析を進めた。本研究で開発したRac1の活性化部位の検出法を応用して、核周辺領域で活性化されるRac1が、受容体エンドサイトーシスを抑制する機構の解析を行なった。また、Rasファミリーの一種であるRap1を介するリンパ球のインテグリン依存性接着の制御系において機能するグアニンヌクレオチド交換因子(RA-GEF-2)の活性調節機構を検討した。さらに、この分子と類縁のRA-GEF-1が胎生期の血管形成に関与する可能性に関する検討を進め、RA-GEF-1ノックアウトマウスと野生型マウスの尿膜におけるRap1の活性化状態を比較、検討した。