GTP結合型低分子量GTPaseの細胞内局在の網羅的解析

GTP结合低分子量GTP酶细胞内定位的综合分析

基本信息

批准号：
17017025
负责人：
佐藤孝哉
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17017025/
关键词：
Cdc42 Rac1 GTP結合型インスリン筋肉糖取込み

项目摘要

まず、タグの改良により、従来のシステム以上に高感度に活性型Cdc42を検出する測定系の確立に成功した。また、Rac1特異的な結合配列を見い出し、培養細胞系において、内在性Rac1の活性化部位の可視化に成功した。高性能の蛍光標識やELISA法の採用に関しては、予備的な条件検討を行ない、近い将来応用できる手掛かりが得られた。一方、活性型Rasファミリー蛋白質の可視化法の確立に関しては、まず第一段階として、Rasに対しては結合能を示すが、類縁のRap1に対しては親和性が低い標的分子の結合ドメインを用いて、活性化Rasのin situ可視化の条件検討を進めてきた。さらに、平成17年度に確立した内在性Rac1の活性化部位の可視化技術を筋細胞に応用し、インスリン刺激に応答した糖取込み誘導のシグナル伝達系におけるRac1の機能解析を行なった。筋細胞株L6をインスリン刺激すると、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)依存性および非依存性のシグナル伝達系を介して、Rac1の活性化が認められた。Rac1の活性化されている細胞内領域を解析したところ、PI3K依存性の活性化は細胞表面のラッフル膜上で起こり、PI3K非依存性の活性化は細胞内膜系で起こることが明らかとなった。さらに、PI3K依存性の細胞膜表面でのRac1の活性化を制御するグアニンヌクレオチド交換因子を同定し、その恒常的活性型は細胞膜表面のRac1を特異的に活性化することが、今年度新たに開発した活性化Rasのin situ可視化法により示された。

首先，通过改进标签，我们成功建立了一个测量系统，该系统检测比常规系统更高灵敏度的活动CDC42。此外，还发现了Rac1特异性结合序列，并在培养的细胞系中成功可视化了内源性Rac1的激活位点。研究了有关采用高性能荧光标签和ELISA方法的初步条件，并获得了可以在不久的将来应用的线索。另一方面，关于建立一种可视化活性RAS家族蛋白的方法，作为第一步，我们一直在研究使用靶分子的结合域对激活的Ras进行原位可视化的条件，而目标分子的结合域显示了RAS的结合能力，但对相关RAP1的亲和力较低。此外，我们应用了2005年建立的内源性RAC1激活位点的可视化技术，并分析Rac1在信号转导系统中Rac1的功能，以诱导糖摄取胰岛素刺激。胰岛素刺激L6通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）依赖性和独立的信号传导系统表现出RAC1的激活。对Rac1活化的细胞内区域的分析表明，PI3K依赖性激活发生在细胞表面的荷叶膜上，而PI3K无关的激活发生在细胞内膜系统中。此外，鉴定了调节RAC1在PI3K依赖性细胞膜表面激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子，其组成型活性形式明确激活了细胞膜表面上的Rac1，该表面在本年度在现场可视化方法中新开发的活性RAS。