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超好熱菌を宿主とした遺伝子発現系の構築

以超嗜热细菌为宿主的基因表达系统的构建

基本信息

批准号：
18018026
负责人：
跡見晴幸
金额：
$ 5.44万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は以前にTK1761が耐熱性β-glycosidaseをコードすることを明らかにした。本β-glycosidaseの基質特異性がp-nitro-pheny1 (pNp)-β-D-glucopyranoside≒pNp-β-D-mannopyranoside>pNp-β-D-galactopyranosideであることが分かった。本研究ではTK1761のreporter遺伝子としての利用を検討した。T. kodakaraensisの無細胞抽出液にはクロマトグラフィーで分離可能な2種のβ-glycosidase活性が存在することが分かった。そこでこれら2種の基質特異性を検討した結果、片方はortho-nitropheny1-β-D-glucopyranoside (ONPgluco)およびortho-nitropheny1-β-D-mannopyranoside (ONPmanno)を加水分解する活性を示したが、ortho-nitropheny1-β-D-galactopyranoside (ONPgalacto)を認識しないことが判明した。もう一方の酵素はONPgalacto分解活性を示した。TK1761遺伝子を高発現したところ、無細胞抽出液中のONPglucoおよびONPmanno分解活性は顕著に増加したが、ONPgalacto分解活性は宿主細胞のKW128株と同程度であった。したがってONPglucoおよびONPmanno分解活性を測定することにより、TK1761はreporter遺伝子として利用できることが示された。さらにTK1761を利用して始原菌において転写と翻訳が実際並行して起こること(polarity)を初めて証明した。これは遺伝子の発現制御の観点から非常に重要な結果であり、これにより始原菌においても翻訳段階での転写調節が起こり得ることを示唆するものである。さらに薬剤耐性に基づいた遺伝子破壊系を他の超好熱菌に適用し、Thermococcus litoralisでもこの系が利用可能であることが判明した。

I used to think TK1761 was heat resistant. β-glycoprotein was the most common enzyme in the world. The matrix specificity of β-glycoprotein is p-nitro-pheny1 (pNp)-β-D-glucopyranoside pNp-β-D-mannopyranoside> pNp-β-D-galactopyranoside This study discusses the utilization of TK1761's reporter gene. T. Kodakaraensis cell-free extract can be separated into two kinds of β-glycosidase activity. As a result of the matrix specificity study of these two compounds, the activity of ortho-nitropheny1-β-D-glucopyranoside (ONPgluco) and ortho-nitropheny 1-β-D-manopyranoside (ONPmanno) in the hydrolysis of water was demonstrated, and ortho-nitropheny1-β-D-galactopyranoside (ONPgalacto) was identified. The enzyme ONPgalacto decomposition activity of one side was shown. TK1761 strain showed high levels of ONPgluco and ONPmanno decomposing activity in cell-free extract, while ONPgalacto decomposing activity increased in KW128 strain of host cell. Onpgluco and ONPmanno decomposition activity were measured. TK1761 reporter was used. TK1761 is the first to be used in parallel with the original bacteria. This is a very important result of the development of the gene and the regulation of the initial stage of the gene. In addition, it is possible to identify the use of Thermococcus litoralis in the treatment of bacterial diseases.