全mRNAカウンティングの基盤技術開発

总mRNA计数基础技术开发

基本信息

  • 批准号:
    18038010
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.15万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    2006
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2006 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

1、RNA抽出法の検討(1)、抽出法の比較検討RNA抽出に関する様々な方法論の比較検討を行った。難度の高い酵母からのRNA抽出の為にこれまでに開発された方法6種類を取り上げて、同一サンプルからのRNA回収を行い、収量の検討を実施した。抽出法によりRNA回収量に10倍以上の差が有り、そのなかで、長時間65℃で放置するホットフェノール法が最も高い回収率を示した。2、GATC-PCRの反応効率モニター系の開発(1)各ステップの反応効率のモニター試験管内転写により合成した既知量のIVT-RNAとdsDNAを鋳型RNAサンプルに加えた。ここで、これら2種の標準は内部断片に鎖長の多型を持たせておき、競合PCRによる識別定量が可能なように設計した。この標準分子により、GATC-PCRにおける各反応の効率をモニターした。第2鎖合成と制限酵素消化を合わせた効率は95%であり、アダプターDNA付加効率は66%であった。GATC-PCRの反応効率をステップに分けてモニターすることが可能となり、反応条件の最適化ならびに絶対定量値の算出に有用な系を開発することができた。(2)、内部標準による絶対定量値の算出2種類の内在性mRNAに対し、それぞれ同一配列の一部に鎖長の多型を有するRNAを試験管内転写により合成し、鋳型RNAサンプルに加えた。既知量のIVT-RNAは、内在性mRNAに対する内部標準となり、GATC-PCRとは独立してこれら2種類のmRNAの絶対量を算出した。得られた絶対量により、GATC-PCRによるトランスクリプトームの絶対定量値を補正することで、同一サンプル内でのGATC-PCRによる絶対定量値について、高い再現性が得られた。即ち、本内部標準によりGATC-PCRの反応効率全体を補正し、正確な絶対定量値が算出可能となった。
1. RNA extraction method <s:1> 検 discussion (1) comparison of extraction method <e:1> 検 discussion of RNA extraction に related する methods 々な comparison of 検 discussion of を lines った. High difficulty の い yeast か ら の RNA extraction の for に こ れ ま で に open 発 さ れ た method on 6 kinds を take り げ て, same サ ン プ ル か ら の RNA 収 back line を い, 収 の beg を 検 be applied し た. Extraction method に よ り RNA 収 quantity に back 10 times more poor の が り, そ の な か で, long 65 ℃ placed で す る ホ ッ ト フ ェ ノ ー ル が maximum も high い 収 back rate を shown し た. 2, the GATC - PCR の 応 sharper rate モ ニ タ ー started の 発 (1) the ス テ ッ プ の anti 応 sharper rate の モ ニ タ ー planning to write test tube に よ り synthetic し た amount already know の IVT - RNA と dsDNA を type where RNA サ ン プ ル に plus え た. Two の こ こ で, こ れ ら standard は internal fragment に lock type long の を hold た せ て お き, competition-collaboration PCR に よ る quantitative が may identify な よ う に design し た. The <s:1> <s:1> standard molecule によ によ and GATC-PCRにおける each have an anti応 nucleotide effect of をモニタ によ た た た た. The second lock synthesizes と limiting enzymes, digesting を with a わせた efficacy rate of <s:1> 95%, and the であ <s:1> and アダプタ <s:1> DNA addition efficacy rate of <s:1> 66%であった. GATC - PCR の anti 応 sharper rate を ス テ ッ プ に points け て モ ニ タ ー す る こ と が may と な り, anti の 応 conditions optimization な ら び に never work out に useful quantitative numerical の seaborne な started を 発 す る こ と が で き た. (2), internal standard に よ る unique numerical の quantitatively calculate the seaborne 2 kinds の internality mRNA に し, seaborne そ れ ぞ れ same match column の a に lock type long の を す る RNA を planning to write test tube に よ り type synthetic し, where RNA サ ン プ ル に plus え た. Both known quantity の IVT - RNA は, internality mRNA に す seaborne る internal standard と な り, the GATC - PCR と は independent し て こ れ ら 2 kinds の mRNA の unique amount of seaborne を calculate し た. Have to ら れ た unique amount of seaborne に よ り, the GATC - PCR に よ る ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム の unique quantitative numerical を corrected the seaborne す る こ と で, same サ ン プ ル within で の GATC - PCR に よ る unique quantitative numerical に seaborne つ い て, high reproducibility い が ら れ た. That is, ち, the entire を correction of the <s:1> anti応 efficacy of gac-pcr in this internal standard によ となった and the calculation of the correct な absolute value が are possible となった.

项目成果

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  • 通讯作者:
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