新規蛍光プローブを用いたRNA検出法の開発

生きた細胞内で、時間軸・空間軸の観点からRNAを解析し、細胞におけるRNA発現プロファイリング(トランスクリプトーム解析)を行うためには、標的RNAを選択的に直接可視化する技術が必要不可欠である。そこで我々は、RNAのセンシング法の開発を目指し、本研究期間においてRNAのセンシングにおいて最も重要である発色団のデザインと相補鎖との結合時における配列識別能に関する評価を行った。「蛍光発色団のデザイン」「蛍光発色団の発光特性の調査」については前年度までに完了しており、ジアミノナフチリジンが発色団として適した性質を持っていることがわかっている。本年度の研究の第一段階として、DNAを検出対象として、ナフチリジン-核酸ハイブリッドの構造最適化を行った。アミノヘキシルジアミノナフチリジン、アミノエチルジアミノナフチリジン、ビスアミノエチルジアミノナフチリジンを合成し、プローブ核酸へ導入することにより3種類のナフチリジン-核酸ハイブリッドを合成した。ジアミノナフチリジン誘導体の導入方法としては、プローブ核酸の5'末端にウレタン結合を介して導入する方法が最も簡便であることが明らかとなった。蛍光法を用いて相補鎖DNAの検出感度について評価した結果、20倍のS/N比で相補鎖DNAを検出することに成功した。また、ナフチリジンの相補的な位置の塩基の種類によっても大きく蛍光強度が異なるため、SNP検出にも応用できることが明らかとなった。これらの結果は、生体機能関連化学シンポジウム、日本化学会春季年会において発表を行った。さらに、ナフチリジン-核酸ハイブリッドのRNA検出における有用性についての評価を行った。その結果、ナフチリジン-核酸ハイブリッドはRNAを検出対象とした場合においても有効なプローブとなることが明らかとなった。

生きた細胞内で、時間軸・空間軸の観点からRNAを解析し、細胞におけるRNA発現プロファイリング(トランスクリプトーム解析)を行うためには、標的RNAを選択的に直接可視化する技術が必要不可欠である。そこで我々は、RNAのセンシング法の開発を目指し、本研究期間においてRNAのセンシングにおいて最も重要である発色団のデザインと相補鎖との結合時における配列識別能に関する評価を行った。「蛍光発色団のデザイン」「蛍光発色団の発光特性の調査」については前年度までに完了しており、ジアミノナフチリジンが発色団として適した性質を持っていることがわかっている。本年度の研究の第一段階として、DNAを検出対象として、ナフチリジン-核酸ハイブリッドの構造最適化を行った。アミノヘキシルジアミノナフチリジン、アミノエチルジアミノナフチリジン、ビスアミノエチルジアミノナフチリジンを合成し、プローブ核酸へ導入することにより3種類のナフチリジン-核酸ハイブリッドを合成した。ジアミノナフチリジン誘導体の導入方法としては、プローブ核酸の5'末端にウレタン結合を介して導入する方法が最も簡便であることが明らかとなった。蛍光法を用いて相補鎖DNAの検出感度について評価した結果、20倍のS/N比で相補鎖DNAを検出することに成功した。また、ナフチリジンの相補的な位置の塩基の種類によっても大きく蛍光強度が異なるため、SNP検出にも応用できることが明らかとなった。これらの結果は、生体機能関連化学シンポジウム、日本化学会春季年会において発表を行った。さらに、ナフチリジン-核酸ハイブリッドのRNA検出における有用性についての評価を行った。その結果、ナフチリジン-核酸ハイブリッドはRNAを検出対象とした場合においても有効なプローブとなることが明らかとなった。