環境センサー・ヒスチジンキナーゼのヘテロ2量体形成と情報処理機構の解析

环境传感器组氨酸激酶异二聚体形成及信息处理机制分析

基本信息

批准号：
19045014
负责人：
饗場浩文
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒスチジンキナーゼのヘテロ2量体形成を検出するため、大腸菌内two-hybrid法を用いて大腸菌の全てのヒスチジンキナーゼ(30種類)について網羅的に相互作用の有無を検討した。その第1段階として、まず自分自身で相互作用する(ホモ2量体を形成する)ことができるヒスチジンキナーゼ8種類を選択した。その後、これら8種類のヒスチジンキナーゼに関して、異なるヒスチジンキナーゼ間での相互作用(ヘテロ2量体を形成)を解析した。その結果、4対のヘテロ2量体形成候補を見いだした。次にこれらのヒスチジンキナーゼが制御する遺伝子を同定するため、対応するレスポンスレギュレーターを高発現してマイクロアレイ解析を行った。その上で、今年度はBaeSとYedVに注目して解析を進めたところ、BaeSが制御する遺伝子の発現にYedVが必要なこと、他方、YedVが制御する遺伝子の発現にBaeSが必要なことを示す結果を得た。これは、BaeSとYedVの間に遺伝学的相互作用が存在することを示しており、両者がヘテロ2量体を形成し機能することを支持するものと考えた。ヘテロ2量体形成を他の方法によっても確認するため、Split GFP法を試みたが相互作用は検出できなかった。現在、免疫沈降やクロスリンクによって2量体形成能の確認を進めている。今後、2量体形成を妨げた場合に起こる表現型の解析や、ホモ2量体が機能しない条件下(リン酸化ヒスチジンを変異させたものと、キナーゼドメインを欠失させたものをそれぞれ発現させるなど)での表現型解析などを通して、ヘテロ2量体の情報伝達機構における意義を明らかにしたいと考えている。この解析と並行して、レスポンスレギュレーターについても網羅的に相互作用解析を行ったが、相互作用を示す結果は得られなかった。

为了检测组氨酸激酶的异二聚体形成，使用大肠杆菌的两种杂交方法对所有组氨酸激酶（30种类型）大肠杆菌的存在或不存在相互作用。作为第一步，我们首先选择了可以与自己相互作用的八种类型的组氨酸激酶（形成同型二聚体）。然后，分析了这八种组氨酸激酶之间不同组氨酸激酶之间的相互作用（形成异二聚体）。结果，发现了四对异二聚体形成候选。接下来，为了鉴定由这些组氨酸激酶调节的基因，进行了微阵列分析，并用相应的响应调节剂的高表达进行。此外，今年，我们专注于BAE和YEDV，发现结果表明YEDV对于表达BAES控制的基因是必需的，而BAE对于表达YEDV控制基因的表达是必要的。这表明BAE和YEDV之间存在遗传相互作用，支持形成和功能异二聚体。为了通过其他方法确认异二聚体形成，尝试了分裂的GFP，但无法检测到相互作用。目前，我们正在通过免疫沉淀和交联对二聚体形成能力进行确认。将来，我们想通过分析在二聚体形成时发生的表型来阐明异二聚体在信号传导机制中的重要性，并在同型二聚体不正常的条件下（例如表达突变磷酸化的组氨酸和分别删除激酶域的突变磷酸化的组氨酸和那些分别删除激酶结构域）的表型分析）。与此分析同时，对响应调节剂进行了详尽的相互作用分析，但没有获得相互作用的结果。