一塩基多型(SNPs)検出のための修飾DNAアプタマーの創製

创建用于单核苷酸多态性 (SNP) 检测的修饰 DNA 适体

• 批准号: 15011205
• 负责人: 桑原 正靖
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15011205/
• 关键词: 核酸; 有機化学; バイオテクノロジー; 生体生命情報学

酵素や抗体のような活性をもつDNAやRNAが試験管内選択法によって創製されている。このような機能を有する核酸分子(DNA/RNA)の更なる活性の向上や機能の多様化を狙って、タンパク質に見られる官能基を導入した修飾DNAに試験管内選択法を応用する試みがある。そのためには修飾核酸の簡便な酵素的合成法が必要である。これまでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって複数の修飾ヌクレオチドが導入された修飾DNAの酵素的合成は困難であった。本研究では耐熱性DNAポリメラーゼが触媒するPCRの基質となる修飾TTPと修飾dCTPおよび修飾dATPを合成した。複数の修飾ヌクレオシド三リン酸を用いてPCRアッセイを行ったところ、プロピニルリンカーをもつ修飾TTPとメチルアミドリンカーをもつ修飾dCTPを同時に用いた酵素反応系が最も収率よく二重修飾DNAを与えた。また、修飾DNAの酵素的合成に適したポリメラーゼの探索を行ったところ、遺伝子進化ファミリーBに属するKOD Dash DNAポリメラーゼとVent(exo-)DNAポリメラーゼが有用であることが分かった。これらの酸素-修飾基質反応系を用いたPCRにより、ヒドロキシル基やニトリル基、アミノ基、グアニジノ基などを有する二重修飾DNAを簡便に調製できる方法を確立した。次に、アミノ基が修飾されたDNAを用いてDNAのシングルミスマッチ構造を認識するアプタマーの創製を試みた。フルマッチ二重鎖をネガティブ・ターゲット、シングルミスマッチ二重鎖DNAをポジティブ・ターゲットとした試験管内選択法により、CAミスマッチを認識するものを選択する操作を繰り返したところ、ターゲットに結合する修飾DNAの割合は、1ラウンド目では全体の2.4%に過ぎなかったが、6ラウンド終了後には26%まで増加した。今後、目的の活性を持つ修飾DNAを単離し配列解析や機能評価を行う。

Enzyme antibody activity is detected by DNA and RNA in vitro selection. The functional nucleic acid molecules (DNA/RNA) can be modified by the introduction of functional groups into DNA and the in vitro selection method. A simple enzymatic synthesis of modified nucleic acids is necessary. The synthesis of modified DNA enzymes is difficult due to the introduction of multiple modifications in PCR. In this study, the substrate for PCR was modified by TTP and modified by dATP. A plurality of modified DNA sequences are used to modify the DNA sequence. The PCR sequence is used to modify the DNA sequence. The PCR sequence is used to modify the DNA sequence. The PCR sequence is used to modify the DNA sequence. The synthesis of modified DNA enzymes is very important. A simple method for the preparation of double-modified DNA by PCR, DNA sequencing, DNA sequencing and DNA sequencing was established. In addition, the gene expression of DNA was detected by DNA sequencing. The double lock DNA sequence was identified by the method of in vitro selection, and the modified DNA sequence was identified by 2.4% of the total DNA sequence and 26% of the total DNA sequence. In the future, the activity of modified DNA will be separated and analyzed, and the function will be evaluated.

项目成果

Masayasu Kuwahara, Shin-ichi Hososhima, Yumi Takahata, Rina Kitagawa, Atsushi Shoji, Kazuo Hanawa, Akiko N. Ozaki, Hiroaki Ozaki, Hiroaki Sawai: "Simultaneous incorporation of three different modified nucleotides during PCR"Nucleic Acids Res.Suppl.. 3. 37

Masayasu Kuwahara、Shin-ichi Hososhima、Yumi Takahata、Rina Kitakawa、Atsushi Shoji、Kazuo Hanawa、Akiko N. Ozaki、Hiroaki Ozaki、Hiroaki Sawai：“PCR 过程中同时掺入三种不同的修饰核苷酸”核酸研究补充材料 3

Masayasu Kuwahara, Yumi Takahata, Atsushi Shoji, Akiko N.Ozaki, Hiroaki Ozaki, Hiroaki Sawai: "Substrate Properties of C5-Substituted Pyrimidine 2'-Deoxynucleoside 5'-Triphosphate for Thermostable DNA Poltmerases during PCR"Bioorg.Med.Chem.Lett.. 13(21).

Masayasu Kuwahara、Yumi Takahata、Atsushi Shoji、Akiko N.Ozaki、Hiroaki Ozaki、Hiroaki Sawai：“PCR 过程中用于热稳定 DNA 聚合酶的 C5 取代嘧啶 2-脱氧核苷 5-三磷酸的底物特性”Bioorg.Med.Chem.Lett

桑原正靖, 澤井宏明: "試験管内選択法による機能性修飾核酸の創製"未来材料. 9. 51-57 (2003)

Masayasu Kuwabara、Hiroaki Sawai：“通过体外选择方法创建功能修饰的核酸”Future Materials。 9. 51-57 (2003)。