SATIC法による細胞内マイクロRNAイメージング技術の開発

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本法ではこれまでにｍＲＮＡの特異的検出系の開発を行ってきたがｍＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡは２０ｍｅｒ程度の短鎖であるため、増幅反応における開始複合体の形態を最近接塩基対パラメータ（ｎｅａｒｅｓｔ　ｎｅｉｇｈｂｏｒ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を用いた核酸の安定性予測に基づき種々検討した。ｍｉＲＮＡ標的の検出系では、標的のヌクレオチド鎖と検出試薬のひとつである捕捉ヌクレオチド鎖との解離・結合によるターンオーバーがないため、検出感度は概して長鎖のｍＲＮＡ標的よりも劣ることが当初より分かっていた。しかし、本研究において、シグナル増幅をもたらすポリメラーゼ反応による増幅配列の最適化を行ったり、φ２９ＤＮＡポリメラーゼやＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼなど用いる酵素やその組み合わせ等を変更したりすることにより反応効率を高めることができ、当該問題について解決の目途が付けられた。さらに、配列が異なる複数の標的を同時に検出するための蛍光プローブであるチオフラビンT誘導体やマラカイトグリーン等の誘導体を新たに得ることができた。マラカイトグリーンは発光波長がチオフラビンＴよりも長波長にあり（λｅｍ　＝　６３０ｎｍ）、従来、核酸プローブとして使用されてきたが、疎水性が高く非特異的な吸着等の問題があった。本研究では、エチレングリコール鎖等の導入により親水性を高めた誘導体を設計・合成することができた。