一塩基多型(SNPs)検出のための修飾DNAアプタマーの創製

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ミスマッチ、バルジ、インターナルループなど二重鎖核酸中の非ワトソン?クリック塩基対部位に特異的に結合する分子は、一塩基多型(SNPs)など遺伝子型の違いを検出するのに利用できる。例えば、患者のあるmRNAのcDNAとそれに対応する健常者のDNAをハイブリダイズ(結合)させると、塩基配列中に一塩基多型部位が存在するなら、その部位でシングルミスマッチ構造が生じる。これに蛍光物質などで標識化した「非ワトソン?クリック塩基対結合分子」を加えることでSNPsの存在を知ることができる。このような非ワトソン?クリック塩基対に特異的に結合する分子として修飾DNAアプタマーの創製を試験管内選択法によって試みた。ヒトステロイド5-αレダクターゼ(SRD5A1)遺伝子の一塩基多型領域をターゲットとしてアミノ基修飾DNAアプタマーの試験管内選択を進めたところ、ミスマッチ構造を含む二重鎖DNAターゲットに対して親和性を示すものの濃縮が確認された。そこで濃縮された修飾DNAライブラリをクローニングによって単離し、ターゲットに対する親和性をそれぞれアッセイしたところ、ミスマッチ構造を含むターゲットに対して優位に結合するいくつかのアミノ基修飾DNAアプタマーを見出した。ゲルシフト法(gel-shift assay)やSPR(表面プラズモン共鳴)法を用いて、ターゲットに対する結合解離定数や結合特異性の測定を行い、さらに円偏光二色性スペクトルや熱融解曲線の測定および一次配列解析によって、導入された修飾基が分子認識にもたらす効果について知見を得ることが期待できる。