1分子シーケンシングに適したDNA断片の簡便な調製法の開発

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1分子シーケンシングに適したDNA断片の簡便な調製法は、低コストでハイスループットな生命システム解析を可能にする技術の一つとして有用である。これまで種々の修飾ヌクレオシド三リン酸を合成し、DNA鎖への種々の修飾基の酵素的導入を検討してきた。そこで、本研究ではイソシトシン(iC)-イソグアニン(iG)塩基対を利用したDNAの位置特異的修飾法(DNA鎖内の任意の箇所に修飾基を酵素的に挿入する方法)を応用することによって、mRNAの1分子シーケンシングに適したDNA断片を簡便に調製する技術の開発を試みた。まず、標識分子であるアクリドンの誘導体化し、基質ヌクレオシド三リン酸とのコンジュゲートを合成した。アクリドンはブルー・レーザーによる励起が可能であるので、ヌクレオチド標識に用いる他の蛍光基とは区別することができるという利点に加え、比較的退色し難いことが知られている。合成したアクリドン修飾ヌクレオシド三リン酸をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の基質として作用するかどうか調べたところ、耐熱性DNAポリメラーゼ(KOD dash)に認識され、DNA分子を簡便に標識化することに成功した。さらに、シュードウリジンを原料として2'-デオキシCヌクレオシドを合成しこれを三リン酸化したアナログのPCRにおける基質特性を調べたところ、反応条件の最適化により、DNA鎖に酵素的に導入することが可能であることが分かった。