酵素KatGの分子構造に基づく結核菌の薬剤耐性化メカニズムの解明

基于酶KatG的分子结构阐明结核分枝杆菌耐药机制

基本信息

批准号：
15019037
负责人：
藤原健智
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Shizuoka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

イソニアジドの抗結核作用は、イソニアジド活性化酵素KdtGによる活性化により生じたラジカル中間体が、結核菌に特有の成分であるミコール酸の生合成を阻害することによる。申請者の研究グループは、好塩菌に存在する結核菌KatGのホモログの結晶構造を高分解能で明らかにし、これに基づいてイソニアジド活性化反応に重要な働きをすると予想されるアミノ酸残基や構造をKatG分子中に同定した。それらの機能を詳細に解析するため、特殊な好塩菌/大腸菌シャトルベクターを用いたKatG過剰発現系を利用して、変異酵素を作成するシステムを構築することに成功した。またこれを用いた変異導入によってKatGの分子構造を改変することで、そのイソニアジド活性化作用を大幅に上昇させることにも成功している。Y218A変異により、そのイソニアジド活性化反応は野生型酵素と比較して70倍以上上昇したが、これは、イソニアジド分子のKatG内部へのアクセス経路を形成しているペプチドループの揺らぎを抑える機能を持つTyr218がAlaに置きかえられることでアクセス経路が'やわらかく'なり、基質分子の通過がより容易になったためと考えられる。さらに、活性中心近傍に存在するペプチド問架橋修飾[W95-Y218-M244]の機能を解析するため作成したM244A変異酵素については、その結晶化に成功し、現在構造解析を進めている。

异念珠菌的抗纤维性作用是由由异念珠菌激活酶KDTG激活产生的自由基中间体引起的，抑制了霉菌酸的生物合成，这是结核分枝杆菌特有的成分。申请人的研究小组揭示了Hata结核病Katg的同源物的晶体结构，该katg存在于卤素细菌中，具有很高的分辨率，并且基于此，在Katg分子中鉴定出了在异辛二氮杂活化反应中扮演重要作用的氨基酸残基和结构。为了详细分析这些功能，我们成功地构建了一个使用KATG过表达系统创建突变酶的系统，该系统使用特殊的卤素细菌/大肠杆菌班车载体。此外，通过使用诱变来改变KATG的分子结构，它通过显着增加了其异念珠菌活化效应而成功实现了它。 The Y218A mutation caused the isoniazid activation reaction to be increased by more than 70 times compared to the wild-type enzyme, which is thought to be because Tyr218, which has the function of suppressing the fluctuation of the peptide loop that forms the access pathway to the inside of KatG of the isoniazid molecule, was replaced by Ala, resulting in the 'soft' of the access pathway, making it easier to通过底物分子。此外，创建的M244A突变酶是为分析肽交联修饰的功能[W95-Y218-M244]的功能，该酶已成功地结晶，并且目前正在进行结构分析。