テロメアの1本鎖DNA領域に結合する蛋白質Pot1の高次構造とテロメア調節機構

端粒单链DNA区域结合蛋白Pot1的高阶结构及端粒调控机制

• 批准号: 15023253
• 负责人: 鳥越 秀峰
• 金额: $ 3.9万
• 依托单位: Tokyo University of Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15023253/
• 关键词: テロメアDNA結合蛋白質; テロメア1本鎖DNA; 結合活性; 3次元構造; 速度論的特性

Pot1蛋白質をコードする遺伝子に一連の部分欠失変異を導入し、大腸菌内で大量発現するためのプラスミドを構築した。このプラスミドを大腸菌に導入し、一連の部分欠失変異体の遺伝子を大腸菌内で大量発現することに成功した。また、大量発現した一連の部分欠失変異体の蛋白質を単品にまで精製する系を確立した。この一連の変異型蛋白質と野生型テロメア1本鎖DNA領域との結合活性を解析し、Pot1のN末端側の182アミノ酸残基がテロメアの1本鎖DNA領域との特異的な結合に必要なDNA結合ドメイン(DBD)であることを明らかにした。また、一連の部分欠失変異を導入した様々な長さおよび領域の変異型テロメア1本鎖DNAを調製した。この一連の変異型テロメア1本鎖DNAと野生型Pot1 DBDとの結合活性を解析し、テロメア1本鎖DNAの6塩基GGTTACがPot1 DBDとの特異的な結合に必要な最小の長さであることを明らかにした。Pot1 DBD単独の3次元構造を解析し、つのαヘリックスとつのβシートを有するOB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)foldに属する構造であることを明らかにした。また、テロメア1本鎖DNAの6塩基GGTTACとPot1 DBDとの結合過程の速度論的特性を生理条件で解析したところ、結合速度定数k_<assoc>は約10^4M^<-1>s^<-1>であり、解離速度定数k_<dissoc>は約10^<-2>s^<-1>であった。Pot1 DBDはテロメア1本鎖DNAと結合しやすく解離しやすいことを明らかにした。

A part of the protein sequence of Pot1 was introduced into E. coli, and the protein sequence was constructed. The introduction of these proteins into E. coli was successful, and some of them were found in large quantities in E. coli. A large amount of protein was found in a series of incomplete proteins, and the purification system was established Analysis of binding activity of these heteromorphic proteins and wild-type DNA domain, and analysis of binding activity of the 182-amino acid residue on the N-terminal side of Pot1 and specific binding activity of DNA domain necessary for DNA binding (DBD). A sequence of partial mutations is introduced into the genome, and a sequence of partial mutations is introduced into the genome. The binding activity of this sequence of heteromorphic DNA to wild-type Pot1 DBD was analyzed, and the minimum length necessary for specific binding of 6-base GGTTAC to Pot1 DBD was determined. Pot1 DBD is a unique three-dimensional structure. It is composed of an OB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)fold. The rate-theoretic characteristics of the binding process of the 6-base GGTTAC of the DNA in this lock are analyzed under physiological conditions, and the binding rate k_<assoc>is about 10^4 M ^<-1>s^<-1>, and the dissociation rate k_<dissoc>is about 10^<-2>s <-1>^. Pot1 DBD is made clear by the combination and dissociation of the essential DNA of TeleMaia 1.

项目成果

Torigoe, H., Hari, Y., Obika, S., Imanishi, T.: "Triplex Formation Involving 2'-O,4'-C-Methylene Bridged Nucleic Acid (2',4'-BNA) with 1-Isoquinolone Base Analogue"Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 22. 1571-1573 (2003)

Torigoe, H.、Hari, Y.、Obika, S.、Imanishi, T.：“涉及 2-O,4-C-亚甲基桥核酸 (2,4-BNA) 与 1- 的三链体形成

Torigoe, H., Katayama, T., Umegaki, Y.: "Thermodynamic Analyses of Purine Motif Triplex DNA Formation"Nucleic Acids Res.. 31,s3. 159-160 (2003)

Torigoe, H.、Katayama, T.、Umegaki, Y.：“嘌呤基序三链体 DNA 形成的热力学分析”核酸研究 31，s3。

Torigoe, H., Hari, Y., Obika, S., Imanishi, T.: "Triplex Formation Involving 2'-O,4'-C-Methylene Bridged Nucleic Acid (2',4'-BNA) with 2-Pyridone Base Analogue"Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 22. 1097-1099 (2003)

Torigoe, H.、Hari, Y.、Obika, S.、Imanishi, T.：“涉及 2-O,4-C-亚甲基桥核酸 (2,4-BNA) 与 2- 的三链体形成

Torigoe, H., Kawahashi, K., Tamura, Y.: "Promotion of Triplex Formation by Morpholino Modification : Thermodynamic and Kinetic Studies"Nucleic Acids Res.. 31,s3. 157-158 (2003)

Torigoe, H.、Kawahashi, K.、Tamura, Y.：“通过吗啡啉修饰促进三链体形成：热力学和动力学研究”核酸研究.. 31，s3。

Torigoe, H., Akaike, T., Maruyama, A.: "Rational Combination of Strategies to Achieve Synergistic Stabilization of Triplex"Nucleic Acids Res.. 31,s3. 221-222 (2003)

Torigoe, H.、Akaike, T.、Maruyama, A.：“实现三链体协同稳定的策略的合理组合”核酸研究.. 31,s3。