多重鎖DNA結合蛋白質の高次構造と多重鎖DNA認識機構

多链DNA结合蛋白的高阶结构及多链DNA识别机制

• 批准号: 08249247
• 负责人: 鳥越 秀峰
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08249247/
• 关键词: 三重鎖DNA; DNA結合蛋白質; 高次構造; DNA認識機構; Znフィンガーモチーフ

近年DNA構造として二重らせん構造以外の三重鎖DNA,四重鎖DNAなどの多重鎖DNA構造が注目されている。三重鎖DNAはホモプリン・ホモピリミジン二重鎖(pur・pyr)の主溝に沿ってホモピリミジン単鎖およびホモプリン単鎖がHoogsteen型の水素結合をすることにより形成され、構造維持のためにはMg^<2+>イオンが必要である。pur・pyr配列は真核生物のゲノム中に広く分布しており、遺伝子発現の調節領域や組み換えのホットスポットに位置することから、三重鎖DNAが遺伝子発現調節や組み換えに関与すると考えられている。これまで三重鎖DNA構造に結合する蛋白質は全く知られていなかったが、ヒト癌遺伝子c-mycのプロモーター近傍のpur・pyr配列が分子内で形成する三重鎖DNA構造に結合し、c-mycの発現を制御する三重鎖DNA結合蛋白質MAZは我々は単離した。またアミノ酸配列よりこの蛋白質がCys2His2型の5個のZn finger motifを有することを明らかにした。今年度、この5個のZn finger motifのうちN末端に位置する3個が三重鎖DNAに結合するのに必要な最小領域であることを確立した。またこの三重鎖DNAに結合するのに必要な最小領域の遺伝子をpETベクターにクローニングし、大腸菌内での大量発現系を樹立した。大量発現した大腸菌を破砕した分画を、ヘパリンSepharoseCL-6Bカラム、逆相HPLCカラムに通すことにより、MAZを単品にまで精製することに成功した。精製したMAZを円偏光二色性(CD)で測定し、αヘリックスやβシート構造を有することを見い出した。またMAZが二重鎖DNAよりも単重鎖DNAや三重鎖DNAにより強く結合することも見い出した。現在NMRを駆使してMAZの詳細な高次構造を解析すると共に、ゲルシフト法でMAZの結合特異性を解析している。

In recent years, DNA structures other than double-locked DNA, quadruple-locked DNA and multiple-locked DNA have attracted much attention. Triple-locked DNA is the main channel of pur-pyr, which is necessary for the formation and structural maintenance of Hoogsteen-type water-element binding. The regulatory domain of gene expression in eukaryotic organisms with pur·pyr alignment is composed of two groups of genes, one group of genes and one group of genes. The triple-locked DNA structure binds to proteins that are fully known to the human cancer c-myc and its adjacent pur pyr alignment and intramolecular formation. The triple-locked DNA structure binds to proteins that are known to the human cancer c-myc and its adjacent pur pyr alignment and controls the development of triple-locked DNA binding proteins MAZ. There are five Zn finger motifs in Cys2 His type 2 protein. This year, five Zn finger motifs and three triple-locked DNA binding sites were established. In addition, this triple-locked DNA has established a large number of discovery systems in Escherichia coli by integrating genes in the smallest areas necessary for binding. A large number of coliform bacteria were detected and purified successfully by HPLC, Sepharose CL-6B and MAZ. Fine MAZ polarization dichroism (CD) measurement, α-ray diffraction, β-ray diffraction, etc. MAZ is a double-locked DNA, a single-locked DNA, and a triple-locked DNA. Now NMR is used to analyze the higher-order structure of MAZ, and the binding specificity of MAZ is analyzed by using the same method.

项目成果

Kamiya,M.,Torigoe,H.,Shindo,H., and Sarai,A.: "Temperature Dependence and Sequence Specificity of DNA Triplex Formation" J.Am.Chem.Soc.118. 4532-4538 (1996)

Kamiya,M.、Torigoe,H.、Shindo,H. 和 Sarai,A.：“DNA 三链体形成的温度依赖性和序列特异性”J.Am.Chem.Soc.118。