权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

テロメアの1本鎖DNA領域に結合するPot1蛋白質のテロメア調節機構の構造的基盤

Pot1蛋白结合端粒单链DNA区域的端粒调控机制的结构基础

基本信息

批准号：
17053027
负责人：
鳥越秀峰
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Pot1のN末端側182アミノ酸残基がテロメア1本鎖DNA領域との特異的な結合に必要なドメイン(DBD)であることを既に明らかにしている。大腸菌内での大量発現系を用いたPot1DBDの調製方法についても既に確立しており、この系を用いてPot1DBDを調製した。本研究では、Pot1DBDとd(GGTTAC)の複合体の3次元構造を詳細に解析した。複合体中のPot1DBDの3次元構造は3本のαヘリックスと8本のβストランドを有するOB(oligonucleotide/oligosaccharide binding) foldのファミリーに属することが明らかとなった。複合体中のd(GGTTAC)は、ランダムな構造ではなく屈曲した独特の構造を有していることが明らかとなった。また、Pot1DBD側のK124,D125がd(GGTTAC)側のG1と、Pot1DBD側のT111,S123がd(GGTTAC)側のG2と、Pot1DBD側のT62,K90がd(GGTTAC)側のT3と、Pot1DBD側のS58,D64がd(GGTTAC)側のT4と、Pot1DBD側のR56,L59がd(GGTTAC)側のA5と、Pot1DBD側のY115,Q120がd(GGTTAC)側のC6と水素結合で特異的に結合していることを明らかとなった。次に、d(GGTTAC)とは長さや塩基配列の異なる一連の変異型テロメア1本鎖DNAのオリゴヌクレオチドをDNA合成機で合成し、逆相HPLCで精製した。これらと野生型Pot1DBDとの結合能をゲルシフト法で解析した。6塩基いずれについても他の塩基に置換したり、6塩基より短くしたりすると、Pot1DBDとの結合能が低下した。これより、d(GGTTAC)がPot1DBDとの特異的な結合に必要である、テロメア1本鎖DNA側の最適な塩基配列であることを明らかにした。さらに、複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が考えられるPot1DBD側のアミノ酸残基に点変異を導入するため、点変異導入用発現プラスミドを構築し、大腸菌内での大量発現系を用いて変異型Pot1DBDを調製した。これらとd(GGTTAC)との結合能をゲルシフト法で解析した。S58A, K90AおよびD125Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能がほとんど変化しなかったが、D64A,Q120LおよびK124Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能が有意に低下した。複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が示唆されているアミノ酸残基の中でも、複合体形成への関与の度合が大きいアミノ酸残基と小さいアミノ酸残基があることが推察された。また、複数のアミノ酸残基が1つの塩基を認識している場合には、片方のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されても他方のアミノ酸残基がd(GGTTAC)との結合能を保持し得るように補償する場合があることが推察された。

The N-terminal 182 amino acid residue of Pot1 is a necessary binding site for specific binding in the DNA domain of Pot1. A large number of production systems in Escherichia coli were established by using Pot 1DBD modulation methods. In this paper, the 3D structure of the complex of Pot 1DBD and d (GGTTAC) is analyzed in detail. The 3-D structure of Pot 1 DBD in the complex has a 3-D structure and an OB (oligonucleotide/oligosaccharide binding) fold. d (GGTTAC) in the complex, the structure of the complex. K124, D125 and d (GGTTAC) side G1 on Pot 1DBD side, T111, S123 and d (GGTTAC) side G2 on Pot 1DBD side, T62, K90 and d (GGTTAC) side T3 on Pot 1DBD side, S58, D64 and d (GGTTAC) side T4 on Pot 1DBD side, R56 and L59 and d (GGTTAC) side A5 on Pot 1DBD side Y115, Q120 and d (GGTTAC) side C6 and water element binding specific binding. In addition, d (GGTTAC) and D (GGTTAC) were synthesized by DNA synthesizer and purified by reverse phase HPLC. The binding energy of wild-type Pot 1DBD was analyzed by the method of binding. 6-base, 6-base, 6-base, 6- The most suitable base alignment on the DNA side of this lock is necessary for the specific binding of Pot 1DBD and GGTTAC. In addition, changes in the amino acid residues on the side of Pot1DBD, which are related to the formation of the complex in the three-dimensional structure of the complex, including d (GGTTAC), were introduced. Discovery templates for the introduction of changes were constructed, and a large number of discovery systems found in coliforms were modulated using Pot1DBD. The analysis of the binding energy of GGTTAC S58A, K90A and D125A have lower binding energy than wild-type and D64A, Q120L and K124A have lower binding energy than wild-type and D125A has lower binding energy than wild-type and D64A has lower binding energy than wild-type and D125A has lower binding energy than wild-type and D124A has lower binding energy. The relationship between the three-dimensional structure of the complex and the formation of the complex is related to the relationship between the acid residues and the complex formation. In the case where the binding energy of a plurality of amino acid residues (1) is recognized, the substitution of amino acid residues (2) by amino acid residues (3) by amino acid residues (4) by amino acid residues (4) by amino acid residues (5) by amino acid residues (4) by amino acid residues (5) by amino acid residues (4) by amino acid residues (5) by amino acid residues (4) by amino acid residues (5) by amino acid residues (6) by amino acid residues (4) by amino acid residues (5) by amino acid residues (5) by amino acid residues (6) by amino acid residues (7) by amino acid residues (4) by amino acid residues (5) by amino acid residues (6) by amino acid residues (6) by amino acid residues (7) by amino acid residues (6) by amino acid residues (7) by amino acid residues (6) by amino acid residues (7) by amino acid residues (8) by amino acid residues (7) by amino acid residues (7) by amino acid residues (8) by amino acid residues (7) by amino acid residues (8) by amino acid residues