テロメアの1本鎖DNA領域に結合するPot1蛋白質のテロメア調節の立体構造的基盤

结合端粒单链DNA区域的Pot1蛋白调控端粒的三维结构基础

• 批准号: 17012022
• 负责人: 鳥越 秀峰
• 金额: $ 5.18万
• 依托单位: Tokyo University of Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17012022/
• 关键词: テロメア結合蛋白質; テロメア1本鎖DNA; 3次元構造; ゲルシフト法; 点変異

Pot1のN末端側182アミノ酸残基がテロメア1本鎖DNA領域との特異的な結合に必要なドメイン(DBD)であることを既に明らかにしている。大腸菌内での大量発現系を用いたPot1DBDの調製方法についても既に確立しており、この系を用いてPot1DBDを調製した。本研究では、Pot1DBDとd(GGTTAC)の複合体の3次元構造を詳細に解析した。複合体中のPot1DBDの3次元構造は3本のαヘリックスと8本のβストランドを有するOB(oligonucleotide/oligosaccharide binding) foldのファミリーに属することが明らかとなった。複合体中のd(GGTTAC)は、ランダムな構造ではなく屈曲した独特の構造を有していることが明らかとなった。また、Pot1DBD側のK124,D125がd(GGTTAC)側のG1と、Pot1DBD側のT111,S123がd(GGTTAC)側のG2と、Pot1DBD側のT62,K90がd(GGTTAC)側のT3と、Pot1DBD側のS58,D64がd(GGTTAC)側のT4と、Pot1DBD側のR56,L59がd(GGTTAC)側のA5と、Pot1DBD側のY115,Q120がd(GGTTAC)側のC6と水素結合で特異的に結合していることを明らかとなった。次に、d(GGTTAC)とは長さや塩基配列の異なる一連の変異型テロメア1本鎖DNAのオリゴヌクレオチドをDNA合成機で合成し、逆相HPLCで精製した。これらと野生型Pot1DBDとの結合能をゲルシフト法で解析した。6塩基いずれについても他の塩基に置換したり、6塩基より短くしたりすると、Pot1DBDとの結合能が低下した。これより、d(GGTTAC)がPot1DBDとの特異的な結合に必要である、テロメア1本鎖DNA側の最適な塩基配列であることを明らかにした。さらに、複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が考えられるPot1DBD側のアミノ酸残基に点変異を導入するため、点変異導入用発現プラスミドを構築し、大腸菌内での大量発現系を用いて変異型PotlDBDを調製した。これらとd(GGTTAC)との結合能をゲルシフト法で解析した。S58A,K90AおよびD125Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能がほとんど変化しなかったが、D64A,Q120LおよびK124Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能が有意に低下した。複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が示唆されているアミノ酸残基の中でも、複合体形成への関与の度合が大きいアミノ酸残基と小さいアミノ酸残基があることが推察された。また、複数のアミノ酸残基が1つの塩基を認識している場合には、片方のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されても他方のアミノ酸残基がd(GGTTAC)との結合能を保持し得るように補償する場合があることが推察された。

Pot1 の N terminal side 182 ア ミ ノ acid residues が テ ロ メ ア this lock DNA field と の specific な combining に necessary な ド メ イ ン (DBD) で あ る こ と を both に Ming ら か に し て い る. Within the coliform で の large 発 practice while department を い た Pot1DBD の modulation method に つ い て も に established both し て お り, こ の is を with い て Pot1DBD を modulation し た. This study provides a detailed を and に analysis of the three-dimensional structure of the で で and Pot1DBDとd(GGTTAC) <s:1> complex <e:1>, as well as a た and た analysis. In complex の Pot1DBD の 3 3 dimensional structure は の alpha ヘ リ ッ ク ス と 8 this の beta ス ト ラ ン ド を have す る OB (oligonucleotide/oligosaccharide binding) a fold の フ ァ ミ リ ー に genus す る こ と が Ming ら か と な っ た. In complex の d (GGTTAC) は, ラ ン ダ ム な tectonic で は な く buckling し た を の structure have unique し て い る こ と が Ming ら か と な っ た. Youdaoplaceholder0, Pot1DBD side <s:1> K124,D125がd(GGTTAC) side <s:1> G1と, Pot1DBD side <s:1> T111,S123がd(GGTTAC) side <s:1> G2と, Pot1DBD side <s:1> T62,K90がd(GGTTAC) side <s:1> T3と, Pot1DBD side <s:1> S58,D64が D (GGTTAC) side の T4 と, Pot1DBD side の R56, L59 が d (GGTTAC) side の A5 と, Pot1DBD side の Y115, Q120 が d (GGTTAC) side の C6 と water element combining で specific に し て い る こ と を Ming ら か と な っ た. Long time に, d (GGTTAC) と は さ や salt base with column の different な る の in a row - alien テ ロ メ ア this lock DNA の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を で synthetic DNA synthesis machine し, reverse phase HPLC で refined し た. Youdaoplaceholder5 れらと wild-type Pot1DBDと と <s:1> binding energy をゲ シフト シフト method で analysis た た. 6 salt base い ず れ に つ い て も he の salt base に replacement し た り, 6 salt base よ り short く し た り す る と, Pot1DBD と の binding energy low が し た. こ れ よ り, d (GGTTAC) が Pot1DBD と の specific な combining に necessary で あ る, テ ロ メ ア this lock DNA side の optimum な salt base with column で あ る こ と を Ming ら か に し た. さ ら に, 3 dimensional structural complex の か ら d (GGTTAC) と の complex formation へ の masato and が exam え ら れ る Pot1DBD side の ア ミ ノ acid residues に points - different を import す る た め, point - different import by 発 プ ラ ス ミ ド を build し, coliform で の large 発 department を now use い て - alien PotlDBD を modulation し た. <s:1> れらとd(GGTTAC)と <s:1> binding energy をゲ シフト シフト method で analysis of た た. S58A, K90A お よ び D125A は wild-type と compare し て d (GGTTAC) と の binding energy が ほ と ん ど variations change し な か っ た が, D64A Q120L お よ び K124A は wild-type と compare し て d (GGTTAC) と の binding energy が deliberately low に し た. Complex の 3 dimensional structure か ら d (GGTTAC) と の complex formation へ の masato and が in stopping さ れ て い る ア ミ ノ acid residues in の で も, complex formation へ の の degrees and masato が big き い ア ミ ノ acid residues と small さ い ア ミ ノ acid residues が あ る こ と が push examine さ れ た. ま た, plural の ア ミ ノ acid residues が 1 つ の salt base を know し て い る occasions に は, slice の ア ミ ノ acid residues が he の ア ミ ノ acid residues に replacement さ れ て も fang の ア ミ ノ acid residues が d (GGTTAC) と の binding energy を stay し must る よ う に compensation す る occasions が あ る こ と が push examine さ れ た.

项目成果

Development of Triplex Formation-based Artificial Transcription Factor to Recognize Any Upstream Sequence of Target Genes

开发基于三链体形成的人工转录因子以识别靶基因的任何上游序列

• 发表时间: 2005
• 期刊: Nucleic Acids Symp.Ser. 49
• 作者: Torigoe;H.;Tsukamoto;Y.
• 通讯作者: Y.

"Novel Strategy for Efficient Detection of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) : specific Binding of Mercury (II) Cation to T : T Mismatch Base Pair and That of Silver (I) Cation to C : C Mismatch Base Pair" in "Moleculomics and Thereafter"

“有效检测单核苷酸多态性 (SNP) 的新策略：汞 (II) 阳离子与 T : T 错配碱基对的特异性结合以及银 (I) 阳离子与 C : C 错配碱基对的特异性结合”，《分子组学及其后》

• 发表时间: 2006
• 作者: Torigoe;H.;Ono;A.
• 通讯作者: A.

Thermodynamic analyses of the specific interaction between C:C mismatch base pair and silver(I)cation:Toward the efficient detection of single nucleotide polymorphism

C:C错配碱基对与银(I)阳离子之间特异性相互作用的热力学分析：面向单核苷酸多态性的高效检测

• 发表时间: 2005
• 作者: Hidetaka Torigoe;OTetsuo Kozasa;Ayako Takamori and Akira Ono
• 通讯作者: Ayako Takamori and Akira Ono

Tetraplex Structure of Fission Yeast Telomeric DNA and Its Unfolding by the Interaction with Telomeric DNA Binding Protein Potl

裂殖酵母端粒DNA的四链体结构及其与端粒DNA结合蛋白Potl相互作用的展开

• 发表时间: 2005
• 期刊: Nucleic Acids Symp.Ser. 49
• 作者: Furukawa;A.;Torigoe;H.
• 通讯作者: H.

Combination of Poly (L-lysine)-graft-dextran Copolymer and 2'-O,4'-C-methylene Bridged Nucleic Acid (2',4'-BNA) Modification Synergistically Stabilizes Pyrimidine Motif Triplex at Neutral pH

聚 (L-赖氨酸)-接枝-葡聚糖共聚物和 2-O,4-C-亚甲基桥核酸 (2,4-BNA) 修饰的组合可在中性 pH 值下协同稳定嘧啶基序三重体

• 发表时间: 2005
• 期刊: Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 24
• 作者: Torigoe;H.;Katayama;T.;Obika;S.;Maruyama;A.;Imanishi;T.
• 通讯作者: T.